Лимонна кислота
Лимонна кислота (СН2 – СООН– СОНСООН– СН2СООН) – трьохосновна оксикислота (рис.8.1), розповсюджена в плодах та ягодах.
Рис. 8.1. Структурна формула лимонної кислоти.
Широко використовується у харчовій промисловості при виробництві кондитерських виробів і напоїв, в фармацевтичній, хімічній і текстильній промисловості. Лимонна кислота була ідентифікована у 1893 р. Вемером як продукт метаболізму пліснявих грибів. В наш час ця кислота за об’ємами виробництва займає перше місце серед органічних кислот (більше 350 тис. т на рік).
Раніше лимону кислоту виділяли у вигляді лимоннокислого кальцію із продуктів переробки листя бавовнику, стебел махорки, хвої, ялини і в значних кількостях – із плодів лимонів. Однак, це виробництво є досить дороговартісним і незначним за об’ємом. Тому лимонна кислота була дефіцитним і дорогим продуктом.
Шляхом відбору та направленої селекції виділено активні продуценти органічних кислот. Для одержання лимонної кислоти використовують міцеліальні гриби родів Aspergillus, Penicillium, Mucor, Ustina та ін. На сьогодні основними продуцентами лимонної кислоти є різні штами гриба Aspergillus niger, які відрізняються великою швидкістю росту, легкістю культивування і високим виходом лимонної кислоти по відношенню до маси вуглеводу, що окиснюється. Штами стійкі до зовнішніх впливів і володіють значним конідієутворенням.
У мікроорганізмів синтез лимонної кислоти реалізується в циклі трикарбоновых кислот у результаті конденсації оксалоацетату і ацетил КоА за участю ферменту цитрат-синтетази (рис.8.2).
Необхідні для реакції оксалоацетат і ацетил КоА утворюються із двох молекул пірувату: одна молекула пірувату піддається декарбоксилюванню з утворенням ацетил КоА, інша – карбоксилюється, перетворюючись в оксалоацетат. Піруват утворюється за фруктозо-біфосфатномим шляхом (гліколіз, шлях Эмбдена-Майергофа-Парнаса). Всі ферменти цього шляху, а також піруватдегідрогеназа, піруваткарбоксилаза і цитрат-синтетаза виявлені у A.niger. В результаті цієї реакції одна молекула цукру (С6Н12О6) перетворюється в одну молекулу лимонної кислоти (С6Н8О7).
Надсинтез лимонної кислоти відбувається за умови лімітування росту грибів-продуцентів мінеральними компонентами середовища і одночасним надлишковим вмістом джерела вуглеводу. В умовах лімітування росту гриба нестачею заліза і марганцю після повного поглинання із середовища дефіцитного елементу ріст припиняється, однак продовжується споживання джерела вуглецю, що наявний у середовищі. При цьому у клітинах гриба починає накопичуватися лимонна кислота, яка в подальшому виділяється в середовище. В якості основи середовища зазвичай використовують глюкозний сироп, гідролізати крохмалю і мелясу.
Рис. 8.2. Схема синтезу лимонної кислоти.
У виробництві лимонної кислоти застосовують кілька варіантів процесу.
Поверхневий спосіб реалізують на твердому сипкому середовищі та в рідкій фазі. При рідиннофазній поверхневій ферментації поживне середовище розливають у кювети шаром від 8 до 18 см. Контроль процесу ведуть за показниками титрованої кислотності середовища. Процес вважають завершеним при кінцевій концентрації цукрів близько 1-2 % і рівні титрованої кислотності 12-20%. Вміст лимонної кислоти від рівня всіх кислот досягає 94-98 %. Зброджений розчин зливають у збірник і направляють на обробку; промитий міцелій використовують у виробництві кормів.
Твердофазна ферментація має багато спільного з поверхнево-рідиннофазним процесом. Розроблений в Японії процес Коджі передбачає використання в якості середовища пористого матеріалу (багас, картопля, пшеничні висівки). Матеріал попередньо стерилізують, після охолодження інокулюють суспензією спор продуцента. Ферментація відбувається в лотках при 25-30 ˚С протягом 6-7 діб. Утворену лимонну кислоту екстрагують водою. В Японії 20 % загального об’єму виробництва лимонної кислоти одержують методом Коджі.
Глибинна ферментація проводиться в апаратах об’ємом 50 м3 із заповненням на 70-75 %. В якості посівного матеріалу використовують міцелій, пророщений також в умовах глибинної культури. У виробничий апарат з поживним середовищем (містить 12-15% цукрів) пророщений міцелій передається по стерильній посівній лінії. Ферментацію проводять при 31-32 ˚С при безперервному перемішуванні. В ході процесу кислотоутворення (5-7 діб) підтримують інтенсивний режим аерації (до 800-1000 м3/год) з дробною подачею цукрів, 2-3 підживлення. Вихід лимонної кислоти складає від 5 до 12 %, кінцева концентрація цукрів – 0,2-1,5 %, частка цитрату – 80-98 % від суми всіх органічних кислот.
Загальна технологічна схема виробництва лимонної кислоти включає наступні етапи:
1. Підготовка поживного середовища. Мелясу завантажують у варильний котел, розбавляють водою до певної концентрації вуглеводів (16 %), додають джерела азоту, фосфору і мікроелементи. Встановлюють необхідне значення рН середовища (6,8-7,2) додаванням кислоти або лугу. Для осадження солей важких металів (заліза, магнію і т.д.), що знаходяться в мелясі, розчин обробляють жовтою кров'яною сіллю. Потім середовище стерилізують і охолоджують до температури ферментації. В окремому цеху вирощують посівний матеріал у вигляді спор (конідій) Aspergillus niger.
2. Потім розмножують продуцент у три стадії: у пробірках, колбах і алюмінієвих кюветах. Тривалість кожної стадії – 2-4 доби при 32 °С. Для вирощування у пробірках використовують агаризоване поживне середовище, а в колбах і кюветах – рідке.
3. Ферментація (поверхневим або глибинним способом). Заводи невеликої або середньої потужності використовують поверхневий спосіб. Глибинний спосіб економічно вигідний тоді, коли потужність підприємства перевищує 2500 т лимонної кислоти в рік.
3.1. При поверхневому способі ферментація проводиться на відкритих металевих кислотостійких кюветах заввишки 7-20 см, в яких міцелій продуцента розвивається на поверхні середовища. Кювети розміщують на багатоярусних стелажах у спеціальних камерах при температурі 34-36 °С. У камери подають стерильне кондиціоноване повітря. Цикл бродіння закінчується через 8-9 діб.
3.2. При глибинному способі міцелій гриба занурений у поживне середовище в ферментерах, туди ж подається стерильне повітря. Тривалість культивування - 5-9 діб.
Оптимум рН на стадії кислотоутворення складає 1,7-2,0. В більш лужному середовищі процес зміщується в напрямку утворення щавлевої і глюконової кислот.
4. Після закінчення ферментації міцелій відокремлюють від культуральної рідини. При глибинній ферментації – фільтруванням на фільтрах, при поверхневій – вручну, заздалегідь зливши рідину з кювет. Міцелій промивають, висушують і направляють для використання в якості добавки до корму тварин. Профільтрована культуральна рідина (фільтрат) являє собою водний розчин лимонної кислоти. В 1 л фільтрату міститься 40-50 г лимонної кислоти.
У зброджених розчинах містяться, крім цільової кислоти, також глюконова і щавлева кислоти, залишки незброжених цукрів і мінеральні солі. Для видалення лимонної кислоти із даного розчину її зв’язують гідроксидом кальцію з утворенням важкорозчинного цитрату кальцію:
2 С6Н8О7+3 Са3(С6Н5О7)2+6 Н2О.
Одночасно утворюються солі глюконової і щавлевої кислот, глюконат кальцію Са(С6Н11О7)2 і оксалат кальцію СаС2О4.
Кальцієві солі лимонної і щавлевої кислот випадають в осад, а глюконат кальцію і основна частина органічних і мінеральних компонентів меляси залишаються в розчині. Осад відділяється на вакуум-фільтрі, промивається і висушується.
Лимонну кислоту виділяють із культуральної рідини у вигляді погано розчинної солі – цитрату кальцію, який утворюється при додаванні крейди. Переведення лимонної кислоти у вільний стан досягається при додаванні певної кількості Н2SO4 :
Цитрат кальцію + Н2SO4 Цитрат + Гіпс
Розчин лимонної кислоти фільтрують для видалення гіпсу, концентрують вакуум-випарюванням і потім кристалізують при повільному охолодженні до 8-10 ˚С. Кристали, що виділилися, центрифугують, промивають водою, сушать, фасують.
Готовий продукт містить не менше 99,5 % лимонної кислоти (в перерахунку на моногідрат), зольність – не вище 0,10-0,35 %.
Лимонну кислоту використовують у кондитерській промисловості для підкислення карамелі, пастили, вафель, так як вона добре підкреслює фруктовий смак. Дану органічну кислоту з метою підкислення додають у морозиво, харчові концентрати, маргарин, деякі сорти ковбас і сиру.
Лимонну кислоту застосовують для пригнічення утворення меланоїдинів у згущеному молоці з цукром, її розчином промивають та дезодорують жирову сировину, обробляють перед холодним зберіганням свіже м’ясо, рибу, фрукти з метою стабілізації їх кольору, смаку і запаху.
8.1.2. Молочна кислота
Молочна кислота (СН3 СНОНСООН) – органічна одноосновна кислота (рис. 8.3), що утворюється в результаті анаеробного перетворення вуглеводів молочнокислими бактеріями.
Рис. 8.3. Структурна формула молочної кислоти.
Для промислового виготовлення молочної кислоти придатні тільки гомоферментативні молочнокислі бактерії, що утворюють до 98 % молочної кислоти. Застосовувані штами Lactobacillus delbrueckii, L. bulgaricus не потребують високих вимог до складу поживного середовища і за короткий час дають високий вихід молочної кислоти. На рис. 8.4. наведено схему біосинтезу молочної кислоти.
Рис. 8.4. Схема біосинтезу молочної кислоти з сахарози.
Ферменти: 1 – інвертаза; 2 – фосфорилаза; 3 – гексокіназа; 4 – глюкозофосфатізомераза; 5 – фосфофруктокіназа; 6 – фруктозодифосфатальдолаза; 7 – триозофосфатізомераза; 8 – гліцеральдегідфосфатдегідрогеназа; 9 – фосфогліцераткіназа; 10 – гліцератфосфомутаза та фосфогліцератфосфомутаза; 11 – енолаза; 12 – піруваткіназа; 13 – лактатдегідрогеназа.
У гомоферментативних молочнокислих бактерій тільки 3 % субстрату перетворюється на клітинний матеріал: а решта – трансформується в молочну кислоту, вихід якої досягає до 1,5 %. Теоретично з 1 моля глюкози повинно утворитись 2 моля лактату. На практиці ця величина дещо нижча, 1,8 моля, тобто вихід продукту від субстрату досягає 90%.
Молочнокислі бактерії перетворюють в молочну кислоту різні вуглеводи, тому для промислового одержання цієї кислоти використовують мелясу, молочну сироватку, глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, оцукрений крохмаль та ін. У кожному випадку підбирають найбільш ефективний продуцент.
Для зброджування глюкози або мальтози зазвичай застосовують штами Lactobacillus delbrueckii, L. leichmannii або L. bulgaricus. Для зброджування оцукреного крохмалю використовують суміш молочнокислих бактерій L. delbrueckii або з L. bulgaricus, або зі Streptococcus lactis. При зброджуванні мальтози вихід молочної кислоти вищий при використанні L. bulgaricus або L. casei.
В якості основної сировини використовують мелясу, картопляний оцукрений затор, які розбавляють водою до певної концентрації (12 %), вносять додаткові джерела амінного азоту (вільні амінокислоти), вітамінів та інших біологічно активних речовин у вигляді кукурудзяного або дріжджового екстракту, або витяжку солодових паростків (так як на молочнокисле бродіння біологічно активні речовини чинять позитивний вплив).
Молочну кислоту в промислових умовах одержують методом анаеробної глибинної ферментації. Концентрація цукру в середовищі повинна становити 5-20 %, температура 44-50 оС, рН 6,3-6,5. Тривалість процесу складає 7-11 діб.
В ході процесу бродіння для стабілізації рН, що змінюється, вносять крейду – 3-4 рази протягом доби. Кінцева концентрація утвореного лактату кальцію складає 10-15%, залишкова концентрація цукрів – 0,5-0,7 %. Із 100 г цукрів одержують 80-90 г лактату.
На стадії одержання готового продукту культуральну рідину нагрівають до 80-90 ˚С, потім нейтралізують гашеним вапном до слабколужної реакції. Після відстоювання протягом 3-5 год зважені частинки декантують.
Після цього розчин лактату подають на фільтр-прес. Фільтрат упарюють до концентрації 27-30 %, охолоджують до 25-30 ˚С і кристалізують.
Промиті кристали лактату кальцію відділяють центрифугуванням і піддають розчепленню сірчаною кислотою при 60-70 ˚С.
Реакція проходить відповідно з рівнянням:
Для відділення іонів заліза молочну кислоту (сирець) при температурі 65 оС обробляють жовтою кров’яною сіллю. Тяжкі метали осаджують сульфатом натрію.
Сиру молочну кислоту 18-20 % концентрації упарюють в декілька етапів у вакуум-випарних апаратах до 70 % концентрації.
Відфільтровану кислоту після фільтр-пресу подають на розлив з внесенням невеликих кількостей крейди, при цьому близько 10 % кислоти перетворюється в кристалічний лактат, який зв’язує молочну кислоту.
Молочну кислоту використовують у харчовій промисловості для приготування джемів з метою утворення гарної консистенції, для одержання напоїв, мармеладу, в процесі консервування. Молочна кислота як регулятор рН, покращувач смаку застосовується у виробництві багатьох сирів, квашенні капусти, в сухому концентраті квасу. В хлібобулочному виробництві молочна кислота і лактати збільшують об’єм м'якушки і покращують скоринку хліба при використанні борошна низької якості. Здатність лактатів утримувати вологу застосовують у виробництві ковбас, сирів, дитячого харчування. Молочну кислоту також використовують для прискорення одержання молочно-білкового згустку при виробництві сиру.
Відповідно до ГОСТ 490-2006 кислота молочна харчова в D(-)- L(+) та D,L-формі призначена для використання у харчовій промисловості як харчова добавка Е 270.