рефераты конспекты курсовые дипломные лекции шпоры

Реферат Курсовая Конспект

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО - раздел Философия,     Приходько Н. А., Есимова А. М., Надирова Ж.к....

 

 

Приходько Н. А., Есимова А. М., Надирова Ж.К.

 

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО

ПРОИЗВОДСТВА

 

 

 

Шымкент, 2007

 

Ф.4.7.-008-03

 

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

 

 

ЮЖНО-КАЗАХСТАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М. АУЕЗОВА

 

Приходько Н. А., Есимова А. М., Надирова Ж.К.

 

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА

  Учебно-методическое пособие для студентов специальности 050701 «Биотехнология»

Отбор случайных мутаций

Каждый этап состоит в следующем исходная культура обрабатывается одним мутагеном или разными, взятым в нескольких дозах, обеспечивающих разную… Полученные вариационные ряды сравнивают с контрольным рядом исходной… В результате сравнения выявляют положительные и отрицательные варианты, которыми считают все клоны, уровень продукции…

Отбор среди мутантов, резистентных к антибиотикам

Отбор среди морфологических мутантов Этот вид отбора основывается на частых фактах обнаружения морфологических… Основная цель использования всех описанных методов – сузить диапазон поиска «нужной» мутации, сделать этот поиск менее…

Таблица 7-Группы стрептококков

 

Фекальные (энтерококки)   Молочные   Оральные   Пиогенные  
S. avium S. bo vis S. durans S. equinus S. faecalis (с разновидно- стями S. faecalis subsp. liquefaciens и S. faecalis subsp. zymogenes) S. faecium S. faecium subsp. casseiiflavus   S. cremoris S. lactis S. lactis subsp. diaceti- lactis S. raffinolactis S. thermophilus     S. milleri S. mitior S. mutans S. salivarius S. sanguis   S. acidominimus S. agalactiae S. anginosus S. disgalactiae S. equi S. equisimilis S. pyogenes S. иberis S. zooepidemicus  

 

Многие виды молочнокислых бактерий растут не только в анаэробных условиях, но и при доступе молекулярного кисло­рода. Однако в присутствии 02 у них не происходит переклю­чения с брожения на аэробное дыхание и не изменяется способ синтеза АТФ (только путем субстратного фосфорилирования). Поэтому молочнокислые бактерии относят к категории аэротоле­рантных анаэробов. Характерное свойство молочнокислых бактерий - высокая спиртоустойчивость: некоторые виды могут расти на средах с 15 - 18% этилового спирта, а единичные - даже при 24%. Способность расти в средах с низким значением рН также свойственна этим микроорганизмам: многие растут при рН от 5,5 до 8,8, некоторые при рН 2,9 - 3,2. Это дает им возможность преобладать в кислых субстратах. Границы температур, в кото­рых возможна жизнедеятельность молочнокислых бактерий, до­вольно широки. Для многих видов оптимальная температура 30—40°С, но имеются и термофилы, растущие при 50°С и выше. Некоторые молочнокислые бактерии способны расти при сравни­тельно низкой температуре (до 3°С). По потребности в питательных веществах молочнокислые бактерии относятся к наиболее сложным микроорганизмам. Из соединений углерода могут использовать незначительное количество веществ, служащих бактериям источником энергии (моно- и дисахариды, органические кислоты).

 

 

 

Рисунок 5 - Электронно-микроскопические фотографии клеток, выращенных в жидкой среде. А - Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis, ´ 7500; Б - L. curvatus, ´ 24 000; B - L. brevis, ´ 7800; Г - L. cellobiosus, ´ 7800; Д, Е - L. coprophilus, ´ 7800.


Молочнокислые бактерии, как правило, нуждаются в сложных органических соединениях азота. Они растут на средах с по­добранными смесями аминокислот, ферментативными или кис­лотными гидролизатами белков - мяса, лактальбумина, казеина, различных сортов муки. Потребность в наборе и количестве отдельных аминокислот варьирует у различных видов. Большин­ству необходимы аргинин, цистеин, глутаминовая кислота, лейцин, фенилаланин, триптофан, тирозин, валин. Только некоторые молочнокислые бактерии (стрептококки) могут расти на средах, содержащих аммонийные соли в качестве единственных источ­ников азота. Большинству молочнокислых бактерий необходимы витами­ны (рибофлавин, тиамин, пантотеновая, никотиновая, фолиевая кислоты, пиридоксаль и др.). Этим в значительной мере объяс­няется влияние на рост бактерий добавок к средам различных растительных экстрактов (картофель, морковь, кукуруза и др.), дрожжевого автолизата и других витаминсодержащих соедине­ний. Выраженная потребность отдельных штаммов молочнокис­лых бактерий в определенных витаминах и аминокислотах ис­пользуется для определения этих соединений в разнообразных средах до восьми витаминов и до восемнадцати аминокислот). Рост молочнокислых бактерий стимулируют и некоторые пептиды,пурины (аденин, гипоксантин, гуанин) и пиримидины (урацил, тимин и др.), жирные кис­лоты (уксусная, олеино­вая) , а также лимонная кислота (часто вводит­ся в среды для выращи­вания бактерий).

 

4. Способность продуцировать ту или иную кислоту – широко распространенное среди микроорганизмов свойство. В качестве производственных культур используют специально подобранные штаммы, продуцирующие целевую кислоту в виде монопродукта с высокими выходами и эффективным усвоением углеродного субстрата. При многих производствах органических кислот экономический коэффициент по углероду достигает 90 % и выше. В качестве продуцентов используют бактериальные, дрожжевые и грибные культуры (Lactobacillus, Arthrobacter, Alcaligenes, Candida, Aspergillus, Penicillium, Trichoderma). Способы ферментации в микробиологических процессах производства органических кислот – разнообразны. Среди них – поверхностные жидко- и твердофазные процессы, а также глубинные, включая проточные культуры. В последние годы разработаны принципиально новые и эффективные биотехнологии с использованием иммобилизованных целых клеток и ферментов. Также разнообразны и субстраты, используемые в производстве органических кислот. Применяемые в начале века глюкоза и сахароза со временем стали заменять более доступными комплексными средами (мелассой, гидролизным крахмалом); в 60-е годы были разработаны новые процессы получения органических кислот на жидких парафинах нефти.

Пропионовокислые, или пропионовые бактерии были впервые выделены из сыров в 1878г. Фитцем и сыроделие – самая древняя биотехнология, использующая эти бактерии. Свое название они получили в связи с образованием при брожении больших количеств пропионовой кислоты. Характеризуются образованием в значительном количестве корриноидов (витамин В12) и каталазы, даже при росте в анаэробных условиях. Представлены бесспоровыми, неподвижными грамположительными палочками (0,5 × 0,7 – 2 мкм) и объединены в семейство Propionibakteriaceae. Содержание ГЦ в ДНК 65 – 68 мол. %. Подразделяют на «классические» и «кожные», последние ранее относили к коринебактериям. «Классические» пропионовокислые бактерии по современной классификации подразделены на четыре вида, вместо одиннадцати ранее описанных. Сокращение числа видов произведено главным образом на основании высокой степени гомологии ДНК представителей разных видов, хотя фенотипические свойства в их хорошо различимы, чем, видимо, объясняется частое употребление в литературе прежних названий.

 

Таблица 8-Некоторые характеристики классических пропионовых бактерий (Propionibacterium)

 

Современное название Прежнее название Г + Ц (мол. %) Компоненты клеточных стенок
P.freudenrechii   P.freudenrechii P. shermsni 65-66 Галактоза, манноза, рамноза   Мезо – ДАП
P. thöenii P. thöenii P. rubrum 66-67 Комбинации из глюгозы, галактозы и маннозы     L - ДАП
P. jensenii P. jensenii, P. zeae, P. technicum, P.petersonii, P. raffinosaceum 66-67  
P.acidipropionici P. arabinosum P. pentosaceum 66-67  

 

В последние годы в род Propionibakterium предложено включить кокки, имеющие с палочковидными бактериями много общих фенотипических свойств и высокую степень гомологию ДНК. Кокки выделяют из молока и сыров на ранних стадиях созревания. В отличие от типичных пропионовых бактерий, кокки растут на поверхности плотных сред. Классические пропионовые бактерии выделяют главным образом из сыров и молочных продуктов, кожные - живут обычно на поверхности кожных покровов человека и в желудке жвачных. Поэтому оптимум температуры, необходимо для роста, 37 0С, а для классических пропионовокислых бактерий 278 -32 0С. Кожные пропионовокислые бактерии обладают противолитической активностью. В отличие от классических видов они разжижают желатину и гидролизуют казеин. Кроме протеаз образуют и другие экстрацеллюлярные ферменты: гиалоуронат – лиазу, липазу, кислую фосфатазу. Кожные пропионовые бактерии представляют собой три вида: P. acnes, P. avidum и P. qranulosum. Изучают их главным образом в связи с этилогией и лечений кожных забеливаний, которые эти бактерии могут вызывать. Представители вида P. acnes входят в состав естественных микроорганизмов рубца жвачных. Они снабжают животных витамином В12, а также превращают углеводы в пропионовую и уксусную кислоты. Пропионат включает в синтез гликогена, а ацетат учувствует в синтезе жиров. Пропионовокислые бактерии обычно выделяют, используя среду следующего состава (%): триптиказа (BBL) – 1; дрожжевой экстракт (Difco) – 1,0; лактат натрия – 1; КН2РО4 – 0,25; MnSO4 – 0,0005; агар – агар (Difco) – 1,5; вода дистиллированная. Начальное значение рН - 6,8 – 7. лактат обусловливает некоторую элективность среды. Бактерии обусловливают некоторую элективность среды. Бактерии растут в анаэробных условиях; создают их путем внесения в среду восстановителей (например, 0,5 % сульфата натрия или 0,05 % цистеина + 0,05 % твина - 80), выращивание в толще среды или помещая чашки с инокулированной средой в анаэростаты, заполненные на 10 – 20 % углекислоты. Культуру рекомендуют поддерживать на среде, приготовленную из мяса, в закрытых пробирках в атмосфере углекислоты при комнатной температуре. Жизнеспособность клеток в таких условиях сохраняется в течении многих месяцев. Присутствие глюкозы в среде не способствует сохранению жизнеспособности культуры и вносить её в среды для хранения не рекомендуется. Классические пропионовые бактерии используют глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу и все (кроме P. freudenreichii) – лактозу. P. technicum и пропионовокислые кокки утилизируют крахмал. Отношение мальтозы и сахарозы – диагностический признак при дифференциации видов. Ассимилируют углекислоту. На пропионовокислых бактериях было впервые доказана способность гетеротрофов к фиксации СО2. В качестве источника азота используют соли аммония. P. acidi propionici восстанавливают нитраты; у некоторых видов установлена способность к фиксации молекулярного азота. Используют ряд соединений серы: от сульфата до сульфида. Потребление пропионовыми бактериями элементарной среды – явление довольно необычное, так как среди гетеротрофных бактерий оно встречается редко. Утилизация среды происходит при непосредственном контакте с клетками и сопровождается восстановлением её до сульфида. Обычно имеется потребность в трёх витаминах: биотине, пантотеновой кислоте и тиамине, необходимого для осуществления пропионовокислого брожения. В целом пропионовокислые бактерии обладают хорошими синтетическими способностями и могут расти на простой синтетической среде следующего состава: соединение углерода – 1-2%; сульфата аммония – 0,3 %; К2НРО4 – 0,2%; СоСl2 × 6Н2О – 1 мг/л; биотин – 0,1 мг/л; тиамин – 100мг/л; пантотеновая кислота – 1000 мг/л.

Уксуснокислые бактерии относятся к грамотрицательным аэробным хемоорганогетеротрофам. От других бактерий, обла­дающих указанными свойствами, они отличаются способностью активно осуществлять разнообразные окислительные трансфор­мации первичных спиртов, гликолей, полиолов, альдо- и кетосахаров, а также их производных. К настоящему времени известно более восьмидесяти подобных трансформаций, производимых уксуснокислыми бактериями, в том числе окисление этилового спирта до уксусной кислоты, глюкозы до 2- и 5-кетоглюконовых кислот, превращение глицерина в диоксиацетон и сорбита в сорбозу. В природе уксуснокислые бактерии обитают на листьях, цветах и плодах многих растений. Их можно обнаружить на пче­лах и в созревающем меде, в почвах фруктовых садов и вино­градников, в растительных соках, вине и пиве, молоке и кисломо­лочных продуктах. Некоторые из них проявляют себя как фитопатогены. Как установил еще Л. Пастер (1868), «болезни» вина и пива, их порча — результат жизнедеятельности микроорганизмов, в частности уксуснокислых бактерий. На поверхности зрелого ви­нограда, яблок и других плодов, используемых как сырье в вино­делии, всегда присутствуют уксуснокислые бактерии. Вследствие размножения клеток и активности синтезируемых ими ферментов в вине снижается содержание спирта и Сахаров, происходят из­менения в составе органических кислот, оно мутнеет, иногда ослизняется. Аналогичные процессы происходят при развитии уксуснокислых бактерий в пиве. Поэтому в технологии виноделия и пивоварения- предусмотрены мероприятия, устраняющие воз­можность размножения этих бактерий на всех этапах произ­водств. В настоящее время специализированные промышленные предприятия культивируют уксуснокислые бактерии с целью получе­ния сорбозы как промежуточного соединения в синтезе витами­на С, диоксиацетона, пишевого уксуса. В лабораторных условиях с помощью уксуснокислых бактерий получают некоторые редкие сахара и органические кислоты, а также их радиоактивные пре­параты, необходимые для научных исследований. К группе уксуснокислых бактерий относят два рода бактерий: Aceiobacter и Giuconobacter. Первый род объединяет ряд видов среди них Aceiobacter aceti, A. xylinym, A. rancens (син. A. pas-teurianus), A. peroxydans. Второй представлен одним видом Glu­conobacter oxydans. Объекты многих исследований по физиоло­гии и биохимии бактирий A. suboxydans и A. melanogenum ранее описанные как самостоятельные виды рода Aceiobacter, в настоя­щее время рассматривают как подвиды G. oxydans или как сино­нимы этого вида. Клетки ацетобактеров — прямые или слегка изогнутые палоч­ки (0,6—0,8 X -1,0—3,0 мкм). Клетки глюконобактеров также палочковидные или эллипсоидной формы (0,6—0,8X1,5— 2,0 мкм): Для бактерий этих родов характерно образование ин­волюционных форм — гипертрофированных клеток, часто ните­видных со вздутиями. Это явление наблюдается в культурах ук­суснокислых бактерий в условиях, не благоприятных для раз­множения (клетки растут, но не могут делиться). Считают, что представители рода Aceiobacter — перитрихи, тогда как G. oxydans — лофотрих. Однако имеются наблюдения, свидетельствующие, что у глюконобактеров встречаются клетки с единичными боковыми жгутиками, а ацетобактеры обладают наряду с одним полярным жгутиком тремя — пятью боковыми.

 
Уксуснокислые бактерии относятся к мезофилам. Оптималь­ная температура их роста 25—30 °С. Приспособлены к существо­ванию в кислой среде. Максимальная скорость роста отмечается при рН 5,4—5,8. Однако они могут размножаться и производить окислительные трансформации и при рН 3,5—4,5, а отдельные представители — даже при рН 2,5. Уксуснокислые бактерии не разлагают белки, не используют аминокислоты в качестве источ­ника углерода и поэтому не растут на мясопептонных средах. Они лишены внеклеточных протеиназ, амилолитических и липолитических ферментов. В качестве источника азота уксуснокислые бактерии исполь­зуют минеральные соли, лучше всего аммонийные. Их рост в син­тетических питательных средах часто зависит от наличия вита­минов, потребности в которых у разных видов различны. Так, G. oxydans нуждается в пантотеновой, пара-аминобензойной и никотиновой кислотах. В промышленности в питательные среды для G. oxydans добавляют дрожжевой или кукурузный экстракты. Л. aceti сам син­тезирует все необходимые витамины и поэтому растет в синтети­ческих питательных средах без их добавления. Для бактерий рода Acetobacter лучшим соединением углерода является уксусная кислота. Они хорошо растут также в средах, содержащих этиловый спирт или молочную кислоту, превращая их в уксусную. Ацетобактеры окисляют уксусную кислоту в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК). У некоторых из них функциониру­ет также глиоксилатный цикл .Глюконобактеры хорошо растут в средах, содержащих глюко­зу, фруктозу, сорбит или глицерин. Этиловый спирт и уксусную кислоту в качестве источника углерода они не используют и ук­сусную кислоту не окисляют. G. oxydans обладает неполным ЦТК. У этих бактерий отсутствует сукцинатдегидрогеназа и, со­ответственно, янтарная кислота не превращается в фумаровую. С целью выделения уксуснокислых бактерий из различных источников (пиво, вино, уксус, фрукты и др.) накопительные культуры получают в пивном сусле, дрожжевой воде или в вод­ном растворе дрожжевого экстракта с 0,5 % этанола или 1 % глюкозы. Исходное значение рН — 5,5. Ввиду того, что эти пита­тельные среды не достаточно элективны для уксуснокислых бак­терий, после стерилизации к ним добавляют пенициллин (20 МЕ/мл) и нистатин (200 МЕ/мл} с целью подавления роста грамположительных бактерий и грибов. При необходимости мож­но использовать и другие аналогично действующие антибиотики. Посевы инкубируют при 30 °С в течение 72 ч.
 
Выделение чистых культур уксуснокислых бактерий из нако­пительных обычно производят общепринятыми методами на двух агаризованных средах: дрожжевой воде с 3 % глюкозы и с 3 % этанола. В обе среды добавляют 0,5 % СаСОз. После семи суток инкубирования посевов отбирают колонии: на среде с глюкозой с отчетливыми зонами растворения мела вследствие образования глюконовой кислоты, на среде с этанолом — с белым диффузным ореолом, возникающим в результате вторичного образования СаСОз ввиду окисления бактериями Са-ацетата. Посевы из ото­бранных колоний производят на те же жидкие или агаризован-ные питательные среды; если с глюкозой, то с добавлением СаСОз, если со спиртом, то без мела. Известны и другие от­носительно простые методы выделения уксуснокислых бак­терий.

Производство органических кислот методом микробиологического синтеза – относительно молодая отрасль промышленности. Исключение составляет производство уксусной кислоты, которую вырабатывают из винного спирта микробиологическим путем очень давно. Получение других органических кислот, в первую очередь лимонной кислоты, с помощью микроорганизмов началось в 20-30-е годы нашего века. Пищевые кислоты до этого выделяли в ограниченном количестве из естественных источников, лимонную кислоту – из сока лимонов, винную – из винного камня (отхода винодельческого производства). Современное производство органических кислот, существующее в большинстве промышленно развитых странах, основано главным образом на использовании в качестве продуцентов различных штаммов плесневых грибов, чаще всего Aspergillus niger. Источником углерода в этих процессах являются углеводы – кристаллические сахароза и глюкоза, свекловичная и тростниковая меласса, гидролизаты древесины, крахмалосодержащие материалы. С помощью микроорганизмов возможно получение более 50 различных органических кислот. В настоящее время только шесть кислот производятся в промышленных масштабах микробиологическим путем (лимонная, итаконовая, глюконовая, 2-кетоглюконовая, уксусная, молочная).

Органические кислоты широко используют в пищевой и фармацевтической промышленности, в технике и в качестве химического сырья. Отдельные органические кислоты (лимонную, яблочную) можно получать экстракцией из природного растительного сырья; другие (уксусную, молочную) – в процессах органического синтеза. Более 50 органических кислот могут быть получены на основе микробиологического синтеза. Биотехнологические методы их получения к настоящему времени детально разработаны. Более того, принято считать, что органические кислоты, полученные в результате микробиологического синтеза, для использования человеком предпочтительнее в сравнение с синтетическими кислотами. Для технических нужд органические кислоты получают химическим путем; применяемые в пищевой и фармацевтической промышленности – в различных биотехнологических процессах. Это производства лимонной, молочной, уксусуной, итаконовой, пропионовой и глюконовой органических кислот; (молочная и уксусные кислоты производятся также и химическим путем).

Органические кислоты в системе микробного метаболизма являются продуктами деградации источника энергии и углерода. Так, лимонная, изолимонная, кетоглутаровая, янтарная, фумаровая и яблочная кислоты – интермедиаты цикла трикарбоновых кислот у большинства аэробных микроорганизмов. Глюконовая, кетоглюконовая и винная кислоты – промежуточные продукты прямого окисления глюкозы (без фосфорилирования) некоторых аэробных бактерий и грибов. Молочная, масляная и пропионовая кислоты являются конечными продуктами метаболизма углеводов у анаэробных бактерий. Уксусная кислота – продукт окисления этанола; а алифатические моно- и дикарбоновые кислоты – промежуточные продукты окисления нормальных алканов. Таким образом, возможности микроорганизмов для получения на основе их метаболизма органических кислот велики.

 
Для сверхсинтеза отдельных кислот нужны селективные, строго определенные условия. При сбалансированном росте микроорганизмов на полноценной среде накопления органических кислот не происходит, так как являясь промежуточными продуктами в системе микробного метаболизма, органические кислоты – исходный материал для синтеза других макромолекул. Время максимальной скорости образования в клетке органических кислот, как и многих других метаболитов, не совпадает во времени со скоростью размножения клеток и накоплением биомассы. Сверхсинтез органических кислот наблюдается при торможении скорости роста продуцента и блокировании процессов биосинтеза, требующих участия кислот в качестве субстрата, то есть при нарушении процессов диссимиляции имеющегося эндогенного субстрата и процессов синтеза основных (азот­содер­жа­щих) компонентов клетки. Такими условиями, как правило, является полное или избыточное содержание в среде источника углерода и энергии и дефицит биогенных элементов, ограничивающих рост клеток. Большинство органических кислот получают, лимитируя рост клеток-продуцентов дефицитом азота или фосфора при избытке углеродсодержащего субстрата. Поэтому микробиологические процессы получения органических кислот – двухфазные : на первом этапе происходит так называемый сбалансированный рост при максимальном накоплении биомассы и потреблении углеродного и энергетического субстрата, а также лимитирующего биогена; на втором – происходит замедление скорости роста клеток. В результате этого прирост биомассы прекращается и начинается интенсивное кислотообразование. Длительность фазы интенсивного кислотообразования определяется наличием углеродсодержащего субстрата в среде. Важным условием кислотообразование большинства органических кислот (за исключением молочной) является хороший режим аэрации, а также величина рН среды.

 

5.Активными продуцентами В12 являются бактерии рода Pseudomonas. Разработаны эффективные технологии на основе термофильных бацилл Bacillus circulans, в течение 18 ч при 65–75°С в нестерильных условиях. Выход витамина составляет от 2.0 до 6.0 мг/л. Бактерии выращивают на богатых средах, приготовленных на основе соевой и рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. Продукция В12 для медицины составляет около 12 т/г; форма выпуска – стерильный раствор CN-В12 на основе 0.95-го раствора NaCl и таблетки витамина в смеси с фолиевой кислотой или другими витаминами. Для нужд животноводства витамин В12 получают на основе смешанной ассоциации термофильных метаногенных бактерий. Ассоциация состоит из 4-х культур, взаимосвязанно расщепляющих органический субстрат до СО2 и СН4: углеводсбраживающих, аммонифицирующих, сульфатвосстанавливающих и собственно метанообразующих бактерий. В качестве субстрата используют декантированную ацетонобутиловую барду, содержащую 2.0–2.5 % сухих веществ. Брожение проходит при 55–57°С в нестерильной культуре в две фазы: на первой образуются жирные кислоты и метан, на второй – метан, углекислота и витамин В12. Длительность процесса в одном аппарате составляет 2.5–3.5 суток, в двух последовательных – 2–2.5 суток. Концентрация витамина в бражке достигает 850 мкг/л. Параллельно в значительных количествах, до 20 м33 образуется газ (65 % метана и 30 % углекислоты). Бражка имеет слабощелочную реакцию. Для стабилизации витамина ее подкисляют соляной или фосфорной кислотой, затем в выпарном аппарате сгущают до 20 % содержания сухих веществ и высушивают в распылительной сушилке. Содержание В12 в сухом препарате – до 100 мкг/г.

Витамин В2 (рибофлавин) получил свое название от сахара рибозы, входящего в состав молекулы витамина в виде многоатомного спирта D-рибита. Широко распространен в природе и в значительных количествах синтезируется растениями, дрожжами, грибами, бактериями. Животные, не синтезирующие этот витамин, должны получать его в составе комбикормов. При дефиците рибофлавина в организме нарушаются процессы белкового обмена, замедляется рост. Препараты рибофлавина используют в медицине для лечения ряда заболеваний, а в животноводстве – в качестве добавки в корма. Микроорганизмы синтезируют рибофлавин и две его коферментные формы – ФАД и ФМН. Продуцентами витамина являются бактерии (Brevibacterium ammoniagenes, Micrococcus glutamaticus), дрожжи (Candida guilliermondii, C. flaveri), микроскопические (Ashbya gossypii, Eremothecium ashbyii) и плесневые грибы (Aspergillus niger).

Эргостерин – (эргоста-5,7,22-триен-3b-ол) – исходный продукт производства витамина D2 и кормовых препаратов дрожжей, обогащенных этим витамином. Витамин D2 (эргокальциферол) образуется при облучении ультрафиолетом эргостерина, который в значительных количествах синтезируют бурые водоросли, дрожжи, плесневые грибы. Наиболее активные продуценты эргостерина – Saccharomyces, Rhodotoryla, Candida.

В промышленных масштабах эргостерин получают при культивировании дрожжей и мицелиальных грибов на средах с избытком сахаров при дефиците азота, высокой температуре и хорошей аэрации. Более интенсивно эргостерин образуют дрожжи рода Candida на средах с углеводородами. При получении кристаллического препарата витамина D2 культивируют плесневые грибы (Penicillium, Aspergillus). Для получения кормовых препаратов облучают суспензию или сухие дрожжи (Candida).

 

7. Продуцентами антибиотиков являются бактерии, актиномицеты, мицелиальные грибы. Описано около 600 антибиотиков, которые синтезируются бактериями. Эти антибиотики по химическому строению принадлежат к полипептидам и низкомолекулярным белкам. Однако в промышленных масштабах выпускается незначительное число антибиотиков бактериального происхождения. Важнейшими их них являются: грамицидин (Bacillus brevis), полимиксины (Bac. polymyxa, Bac. circulans), бацитрацины (Bacillus licheni­formis), низины (Streptococcus lactis). Самое большое количество (свыше 70 %) антибиотиков, выпускаемых промышленностью и широко применяемых, синтезируется актиномицетами. Среди них – антибиотики различного химического строения, которые относят к нескольким группам: а) аминогликозиды – стрептомицин (Strepto­myces griseus), неомицины (Streptomyces fradiae, Str. albogriseolus), канамицины (Str. kanamyceticus), гентамицины (Micromonospora purpurea) и др.; б) тетрациклины – хлортетрациклин (Str. aureofaciens), окситетрациклин (Str. rimosus); в) актиномицины – большая группа близких по строению препаратов, синтезируемых различными микроорганизмами, в том числе (Streptomyces antibioticus, Str. chrysomallus, Str. flavus); г) макролиды – эритромицин (Streptomyces erythreus), олеандоимицин (Str. antibioticus), магнамицин (Str. halstedii), филипин (Str. filipensis); д) анзамицины – стрептоварицины (Str. spectabilis), рифамицины (Nocardia mediterranea), галамицины (Micromonospora halophytica), нафтамицин (Str. collinus) и др. Мицелиальные грибы также синтезируют достаточно большое количество антибиотиков (около 1200). Наиболее известны среди них следующие: пенициллины (Penicillium chrysogenum, P. brevicompactum, Aspergillus flavus, Asp. nidulans), цефалоспорины (Cephalosporium acremonium), фумалгин (Aspergillus fumigatus), гризеофульвин (Penicillium nigricans, P. griseofulvum), трихоцетин (Trichthecium roseum). Синтез антибиотиков микробными клетками – это специфический процесс обмена веществ, возникший и закрепленный в процессе эволюции организма. Каждый микробный вид способен образовывать один или несколько вполне определенных антибиотических веществ. Выделенные из природных источников, так называемые «дикие» штаммы обладают низкой антибиотической активностью. В промышленности применяют в качестве продуцентов штаммы, которые по сравнению с исходными штаммами обладают повышенной на 2–3 порядка антибиотической активностью. Это достигается, как и во многих других биотехнологических процессах, двумя способами: генетическими усовершенствованиями организмов и оптимизацией условий ферментации.

 

 

Вопросы для самопроверки

 

1.Первичные и вторичные метаболиты микроорганизмов.

2.Характеристика дрожжей.

3.Характеристика молочнокислых бактерий,

4.Характеристика продуцентов органических кислот, пропионовокислые или пропионовые бактерии

5.Характеристика продуцентов аминокислот, витаминов, ферментов,

6.Характеристика продуцентов кормового белка,

7.Характеристика продуцентов антибиотиков.

8.Синтез антибиотиков микробными клетками

9.Бактерии рода Pseudomonas

10. Препараты рибофлавина

11.Практическое использование молочно­кислых бактерий

12.Производство органических кислот методом микробиологического синтеза

13.Сверхсинтез органических кислот

14.Экономический коэффициент по углероду

Модуль №2. Культивирование микроорганизмов и получение конечных продуктов

 

Лекция 6. Основные стадии и показатели роста микроорганизмов. Виды биореакторов. Периодическое и непрерывное культивирование (Хемостат, турбидостат, оксистат). Стадии разработки биотехнологического производства: лабораторный регламент, опытно-промышленные испытания, промышленное производство, масштабирование

 

Форма проведения лекции: круглый стол - тренинг

 

План лекции

1. Основные стадии и показатели роста микроорганизмов

2. Виды биореакторов

3. Периодическое и непрерывное культивирование (Хемостат, турбидостат, оксистат)

4. Стадии разработки биотехнологического производства: лабораторный регламент, опытно-промышленные испытания, промышленное производство, масштабирование

 

1.В биотехнологии при выборе метода получения конкретного целевого продукта обязательно должна производиться технико-экономическая оценка альтернатив получения подобных продуктов традиционными методами. По сравнению с известными биотехнологические процессы должны быть более технологичными, экономичными и экологичными, либо вообще должны исключать альтернативы. Оценка альтернативности вариантов только через себестоимость продукта – односторонняя. Оценкой эффективности биотехнологии, помимо качества получаемого продукта, может служить сопоставление экспериментального и теоретического выхода продукта, рассчитанные по материально-энергетическому балансу процесса. При этом затраты и стоимость сырья в крупномасштабных биотехнологических процессах, как правило, являются определяющими, поэтому материально-энергетическая оценка в данном случае очень существенна. И, напротив, при использовании процессов на основе высокопродуктивных рекомбинантных штаммов-продуцентов основная доля затрат относится не к сырью, а к созданию продуцента и его поддержанию, а также разработке специальных условий его культивирования, то есть в данном случае экономика сырьевых и энергоресурсов играют второстепенную роль.

В любом биотехнологическом процессе ключевую роль играет биологический агент, его природа и физиолого-технологические свойства. Для роста любого биообъекта нужен исходный жизнеспособный посевной материал, источники энергии и углерода, питательные вещества для синтеза биомассы, отсутствие действия ингибиторов роста, соответствующие физико-химические условия ферментации (рН, температура, аэрация и др.).

Одним из основных показателей, характеризующих адекватность условий ферментации, служит скорость роста продуцента. Скорость роста (увеличение биомассы) организмов с бинарным делением в хорошо перемешиваемой среде в периодической культуре будет пропорционально концентрации микробной биомассы:

dX/dt = mX,

где dX/dt – скорость роста, Х – биомасса, m – коэффициент пропорциональности, («удельная скорость роста»); параметр аналогичен сложным процентам (например, если удельная скорость роста равна 0.1 ч–1, – значит увеличение биомассы равно 10 % в час). Если величина m постоянна, как это бывает в установившемся режиме культивирования, то интегрирование представленного уравнения дает:

lnX = lnX0 + m t,

где Х0 – биомасса в начальный период времени t.

График зависимости lnX от времени будет иметь вид прямой линии с наклоном m. Удельная скорость роста является одним из основных параметров, характеризующих физиологическое состояние продуцента; ряд других параметров может быть выражен через этот показатель.

Продуктивность процесса характеризуется количеством продукта, получаемого на единицу объема биореактора в единицу времени. Продуктивность процесса зависит от многих факторов: активности продуцента, значений коэффициента выхода продукта из потребленного субстрата, количества активной биомассы в ферментере:

П = qs Yp/s X [г/л ч.],

где qs – скорость потребления субстрата (метаболический коэффициент), Yp/s- выход продукта (экономический коэффициент), X – концентрация биомассы, P – продукт, S – субстрат.

Влиять на величину продуктивности можно путем изменения различных ее составляющих, но в каждом конкретном случае это приходится рассматривать отдельно. Так, при повышении величины Х могут возникнуть ограничения по массообменным характеристикам аппарата и лимитирующие состояния; влиять на величину метаболического коэффициента культуры возможно только при условии глубокого знания взаимосвязей между физиолого-биохимическими характеристиками продуцента и условиями среды.

Выход продукта (Y) (экономический коэффициент) определяется как количество продукта, получаемого из данного количества субстрата:

Y = X/SоS,

где S и So – конечная и исходная концентрация субстрата.

Данный коэффициент выражает эффективность использования субстрата для получения целевого продукта и является очень важной характеристикой, так как непосредственно связан с продуктивностью и позволяет непосредственно влиять на себестоимость конечного продукта. Экономический коэффициент имеет четкий физический смысл, характеризующей степень перехода энергии, заключенной в субстрате, в продукт. Данная величина необходима для расчетов и прогнозирования процесса в целом и используется в качестве параметра для контроля и управления ходом различных процессов и сопоставления их эффективности. Конечная концентрация продукта должна планироваться с учетом продолжительности процесса и величины выхода продукта. Достижение конечной высокой концентрации продукта оправдано, когда выделение, концентрирование его трудоемки и дорогостоящи. Удельные энергозатраты существенно варьируют в зависимости от направленности и схемы процесса ферментации, а также условий подготовки сырья на предферментационной стадии и постферментационных процедур. Удельные энергозатраты также очень существенно зависят от типа ферментационного оборудования.

Непродуктивные затраты субстрата (h) – это затраты энергии субстрата, которые не проявляются в приросте продукта. В общем виде они выражаются через экономический коэффициент:

h = Yэкспериментальный/Yтеоретический < 1.

Непродуктивные затраты существенно влияют на эффективность и экономику биотехнологического процесса, поэтому выявление причин и мест этих дополнительных трат энергического субстрата очень важно. Непродуктивные затраты субстрата могут быть связаны с ошибками при считывании генетической информации в ходе быстрого роста продуцента и затратами на поддержание при разобщенном росте в результате снижения эффективности образования энергии в цепи переноса электронов из-за разобщения окисления и фосфорилирования, инактивации мест сопряжения, возникновения альтернативных, менее эффективных ветвей, с диссипацией энергии, а также из-за возрастания трат энергии на поддержание жизни без размножения (транспорт субстратов и мономеров в клетке, ресинтез молекул, защитные реакции, процессы репарации). Первичная оценка эффективности биотехнологических процессов по перечисленным параметрам проводится на стадии лабораторных разработок и испытаний процесса и далее уточняется при масштабировании на опытных и опытно-промышленных стадиях.

 

2.Рассмотрим некоторые типы ферментационных аппаратов.

Аппараты для анаэробных процессов достаточно просты и применяются в процессах конверсии растительного сырья, в том числе растительных отходов, а также различных промышленных отходов. При метановом брожении для получения биогаза, а также в ряде других процессов (получение ацетона, шампанских вин) используют ферментационные аппараты (метанотенки). Эти аппараты имеют различную конструкцию (от простой выгребной ямы до сложных металлических конструкций или железобетонных сооружений) и объемы (от нескольких до сотен кубометров) . Метановые установки оборудованы системой подачи сырья, системой теплообменах труб для стабилизации температуры, несложным перемешивающим устройством для гомогенного распределения сырья и биомассы продуцента, газовым колпаком и устройством переменного объема (газгольдер) для сбора образуемого биогаза.

Рисунок 6 - Схема метановой установки. 1 – дозирующее устройство, 2 – теплообменник, 3 – метанотенк; 4 – газгольдер.


Конструкция аппаратов для аэробной ферментации определяется типом ферментации и сырья. Аппараты для аэробной поверхностной ферментации, широко применяемые для производства органических кислот и ферментов, достаточно просты по конструкции и, соответственно, подразделяются на жидкофазные и твердофазные. Поверхностная жидкофазная ферментация протекает в так называемых бродильных вентилируемых камерах, в которых на стеллажах размещены плоские металлические кюветы. В кюветы наливают жидкую питательную среду, высота слоя составляет 80–150 мм, затем с потоком подаваемого воздуха среду инокулируют спорами продуцента. В камере стабилизируется влажность, температура и скорость подачи воздуха. После завершения процесса культуральная жидкость сливается из кювет через вмонтированные в днища штуцера и поступает на обработку. При твердофазной ферментации процесс также протекает в вентилируемых камерах, но вместо кювет на стеллажах размещают лотки, в которые насыпают сыпучую твердую среду слоем 10–15 мм. Для лучшей аэрации среды подаваемый в камеру воздух проходит через перфорированное днище лотков.

Аппараты для аэробной глубинной ферментации наиболее сложны как конструкционно, так и с точки зрения их эксплуатации. Главная задача, возникающая при их конструировании, – обеспечение высокой интенсивности массо- и энергообмена клеток со средой. Массообмен определяется транспортом (переносом) кислорода и других биогенных элементов из среды в микробную клетку и отводом из нее продуктов обмена. Главным показателем массообменных характеристик ферментера служит коэффициент массопередачи кислорода, так как кислород является основным лимитирующим фактором аэробных ферментационных процессов. Расход кислорода на образование 1 кг биомассы в зависимости от типа углеродсодержащего сырья и степени его восстановленности может составлять от 0.75 до 5.00 кг. Клетки способны утилизировать кислород только в растворенном виде, поэтому необходимо постоянно поддерживать его концентрацию в культуре на уровне, оптимальном для конкретного продуцента. При этом скорость поступления кислорода к клеткам должна превышать скорость его включения в клетки, и в околоклеточном пространстве не должно возникать так называемых «концентрационных ям». Кроме этого, концентрация клеток и растворенного субстрата должны быть равномерными по всему объему ферментера. Поэтому перемешивание является также одним из основных факторов, обеспечивающих требуемую гидродинамическую обстановку в аппарате. При интенсивном перемешивании пузырьки воздуха дробятся в аппарате и диспергируясь увеличивают площадь контакта фаз «среда-клетка». Однако чрезмерное перемешивание может вызвать механическое повреждение биологических объектов. К настоящему времени разработано и применяется огромное количество разнообразнейших перемешивающих и аэрирующих устройств, и классифицировать их практически невозможно. Наиболее удачна, по нашему мнению, попытка классификации ферментационных аппаратов для аэробной глубинной ферментации по подводу энергии . Согласно этой классификации, аппараты такого типа делятся на три группы по подводу энергии: 1) – к газовой фазе, 2) – к жидкой фазе, 3) – комбинированный подвод.

Ферментеры с подводом энергии к газовой фазе (группа ФГ). Их общий признак – подвод энергии в аппарат через газовую фазу, которая является ее носителем. Ферментеры характеризуются достаточно простой конструкцией (отсутствуют трущиеся, движущиеся узлы), высокой эксплуатационной надежностью, но имеют не очень высокие массообменные характеристики (коэффициент массопередачи кислорода менее 4 кг/м3) . Данные аппараты представляют собой вертикальную емкость, снабженную газораспределительным устройством одного из известных типов. Барботажные газораспределительные устройства обычно устанавливаются в нижней части аппарата. Подаваемый сверху через распределительную трубу воздух, пройдя через барботер, насыщает кислородом толщу среды. Коэффициент массопереноса кислорода невысок, 1–2 кг/м3 ч; барботажно-колонный – в нижней части корпуса такого аппарата устанавливается перфорированная пластина с диаметром отверстий 0.0005 м или сопловой эжектор с диаметром сопла 0.004 м; барботажно-эрлифтный аппарат характеризуется наличием внутри одного или нескольких диффузоров («стаканов») или нескольких перегородок для принудительного разделения восходящих и нисходящих потоков циркулирующей жидкости; эти элементы расположены равномерно по сечению аппарата или концентрично; газлифтный колонный ферментер состоит из двух колонн разного диаметра, соединенных между собой; одна представляет собой барботажную колонну с восходящим потоком воздуха, другая – циркуляционная, с нисходящим потоком. Воздух вводится в нижнюю зону аппарата в барботажную колонну; камера, соединяющая колонны в верхней части аппарата, образует большую поверхность контакта фаз; трубчатый аппарат сконструирован по типу теплообменных труб; взаимодействие газа в трубе при высоких скоростях продувки более интенсивное, чем в большом объеме, поэтому массообмен интенсивнее; аппарат с плавающей насадкой позволяет интенсифицировать массообмен за счет увеличения поверхности контакта фаз и турбулизации жидкости при работе с большими скоростями подачи газовой и жидкой фаз. В аппарат введены секционные элементы в виде решеток, оборудованных лопастной насадкой; в центре аппарата находится труба, через которую вводится воздух, а жидкая фаза поступает противотоком сверху. Газ, поступая на лопастную насадку, обычно из полиэтилена, вращает ее; это существенно увеличивает поверхность контакта газовой и жидкой фаз.

Ферментеры с вводом энергии жидкой фазой (группа ФЖ) наиболее сложны по конструкции и энергоемки, но обеспечивают наиболее высокие по сравнению с группой ферментеров ГФ значения коэффициента массопередачи кислорода, свыше 6 кг/м3 ч. В данных аппаратах ввод энергии осуществляется жидкой фазой, обычно самовсасывающими мешалками или насосами; в последнем варианте жидкость вводится в аппарат через специальное устройство (сопло, эжектор, диспергатор). Данные аппараты также можно подразделит на ряд типов : ферментеры с самовсасывающими мешалками не требуют специальных воздуходувных машин, так как поступление в них воздуха происходит в результате разрежения в воздушной камере мешалки, соединенной с воздуховодом и с жидкостью, отбрасываемой лопатками
мешалки; в эжекционных ферментерах возможна рециркуляция газовой фазы, что экономит субстрат, однако требуется наличие специальных насосов для перекачки газосодержащей культуральной среды. Применение эжекционного ввода газовых субстратов в ферментер может интенсифицировать массообмен на порядок; струйные ферментеры (с затопленной или падающей струей) оборудуются мощными насосами, которые забирают культуральную жидкость из нижней части аппарата и через напорный трубопровод подводят поток к аэрирующему устройству (по типу шахтного перепада или напорно-струйные). Струя жидкости под давлением свободно падает сверху и пронизывает аэрируемую жидкость до дна аппарата. Происходят интенсивные турбулизация и перемешивание жидкости. Внизу жидкость вновь засасывается насосом и снова подается вверх аппарата, то есть возникает замкнутый контур циркуляции. Недостатком данных аппаратов являются потери энергии при перекачке жидкости, трудности проектирования в связи с отсутствием надежных методик расчета конструкций и режимов работы струйных и эжекционных устройств.

 

Рисунок 7 - Ферментеры с подводом энергии газовой фазой (группа ФГ) а) барботажный: 1 – корпус, 2 – воздухораспределитель, 3 – карман, 4 коллектор, б) барботажный колонный: 1 – корпус, 2 – рубашка, 3 – воздухораспределитель, в) барботажно-эрлифтный: 1 – корпус, 2 – диффузор-теплообменник, 3 – воздухораспределитель; г) газлифтный: 1 – корпус,2 – диффузор, 3 – диспергатор, 4 – воздухораспределитель, 5 – теплообменник, д) трубчатый: 1 – пеногаситель, 2 – емкость, 3 – диспергатор, 4 – корпус, 5 – распределительная перегородка, е) с плавающей насадкой: 1 – рубашка, 2 – тарелка, 3 – насадка, 4 – корпус.


Рисунок 8 - Ферментеры с вводом энергии жидкой фазой (группа ЖФ)

а) – с самовсасывающей мешалкой: 1 – корпус, 2 – мешалка, 3 – циркуляционный контур-теплообменник, б) – эжекционный: 1 – корпус, 2 – насос, 3 – эжектор, в) – струйный с затопленной струей: 1 – эжектор, 2 – теплообменник, 3 – корпус, 4 – насос, 5 – рассекатель, 6 – труба с насадкой, г) – струйный с плавающей струей: 1 – теплообменник, 2 – насос, 3 – корпус, 4 – эжектор.

Третья группа аппаратов – с подводом энергии газовой и жидкой фазами (группа ФЖГ). Основными их конструкционными элементами являются перемешивающие устройства всех известных типов, а также наличие в совокупности насосов и перемешивающих устройств. Это могут быть аппараты с группой самовсасывающих мешалок и насосом для перекачивания культуральной жидкости и другие сочетания перемешивающих и аэрирующих устройств. Коэффициент массопереноса кислорода в таких ферментерах может в принципе иметь любые из известных значения.

Перечисленные типы аппаратов возникли в основном в течение «эры» антибиотиков и белка одноклеточных и применяются, главным образом, в технической микробиологии.

Прогресс в области получения клеточных и рекомбинантных культур выдвигает специальные требования к биореакторам. При этом на первый план выдвигаются такие показатели, как стабильность биологических агентов, повышенные требования к асептике, лимитация срезовых условий при перемешивании и др. Однако, многие из таких конструкций пока еще носят экспериментальный характер.

 

3. Стадия ферментации является основной стадией в биотехнологическом процессе, так как в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов (биомасс, эндо- и экзопродуктов). Эта стадия осуществляется в биохимическом реакторе (фер­мен­тере) и может быть организована в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта различными способами. Ферментация может проходить в строго асептических условиях и без соблюдения правил стерильности (так называемая «незащищенная» ферментация); на жидких и на твердых средах; анаэробно и аэробно. Аэробная ферментация, в свою очередь, может протекать поверхностно или глубинно (во всей толще питательной среды).

Рисунок 9 - Схема биореактора периодического действия.

Культивирование биологических объектов может осуществляться в периодическом и проточном режимах, полунепрерывно с подпиткой субстратом. При периодическом способе культивирования ферментер заполняется исходной питательной средой и инокулятом микроорганизмов (Х0 + S0 ). В течение определенного периода времени в аппарате происходит взаимодействие микроорганизмов и субстрат сопровождающееся образованием в культуре продукта (Х + S ® P).

Биохимические превращения в этом аппарате продолжаются от десятков часов до нескольких суток. Регуляция условий внутри ферментера – важнейшая задача периодического культивирования микроорганизмов. В ходе периодической ферментации выращиваемая культура проходит ряд последовательных стадий: лаг-фазу, экспоненциальную, замедления роста, стационарную и отмирания. При этом происходят существенные изменения физиологического состояния биообъекта, а также ряда параметров среды. Целевые продукты образуются в экспоненциальной (первичные метаболиты – ферменты, аминокислоты, витамины) и стационарной (вторичные метаболиты – антибиотики) фазах, поэтому в зависимости от целей биотехнологического процесса в современных промышленных процессах применяют принцип дифференцированных режимов культивирования. В результате этого создаются условия для максимальной продукции того или иного целевого продукта. Периодически ферментер опорожняют, производят выделение и очистку продукта, и начинается новый цикл. Непрерывный процесс культивирования микроорганизмов обладает существенными преимуществами перед периодическим. Непрерывная ферментация осуществляется в условиях установившегося режима, когда микробная популяция и ее продукты наиболее однородны. Применение непрерывных процессов ферментации создает условия для эффективного регулирования и управления процессами биосинтеза. Системы непрерывной ферментации могут быть организованы по принципу полного вытеснения или полного смешения. Первый пример – так называемая тубулярная культура .

Рисунок 10 - Схема тубулярного биореактора полного вытеснения.

Процесс ферментации осуществляется в длинной трубе, в которую с одного конца непрерывно поступают питательные компоненты и инокулят, а с другой с той же скоростью вытекает культуральная жидкость. Данная система проточной ферментации является гетерогенной. При непрерывной ферментации в ферментах полного смешения (гомогенно-проточный способ) во всей массе ферментационного аппарата создаются одинаковые условия. Применение таких систем ферментации позволяет эффективно управлять отдельными стадиями, а также всем биотехнологическим процессом и стабилизировать продуцент в практически любом, требуемом экспериментатору или биотехнологу состоянии. Управление подобными установками осуществляется двумя способами .Турбидостатный способ базируется на измерении мутности выходящего потока. Измерение мутности микробной суспензии, вызванное ростом клеток, является мерой скорости роста, с которой микроорганизмы выходят из биореактора. Это позволяет регулировать скорость поступления в ферментер свежей питательной среды. Второй метод контроля, – хемостатный, проще. Управление процессом в хемостате осуществляется измерением не выходящего, а входящего потока. При этом концентрацию одного из компонентов питательной среды (углерод, кислород, азот), поступающего в ферментер, устанавливают на таком уровне, при котором другие питательные компоненты находятся в избытке, то есть лимитирующая концентрация задающегося биогенного элемента ограничивает скорость размножения клеток в культуре.

Обеспечение процесса ферментации, с точки зрения инженерной реализации, сводится к дозированному поступлению в ферментер потоков (инокулята, воздуха (или газовых смесей), питательных биогенов, пеногасителей) и отвода из него тепла, отработанного воздуха, культуральной жидкости, а также измерению и стабилизации основных параметров процесса на уровне, требуемом для оптимального развития продуцента и образования целевого продукта. В ходе ферментации образуются сложные смеси, содержащие клетки, внеклеточные метаболиты, остаточные концентрации исходного субстрата. При этом целевые продукты, как правило, находятся в этой смеси в небольших концентрациях, а многие из них легко разрушаются. Все это накладывает существенные ограничения на методы выделения и сушки биологических препаратов.

Вопросами технического обеспечения биотехнологических процессов занимается биоинженерия. Для различных процессов существует огромное разнообразие аппаратуры: собственно для процесса ферментации, а также для выделения и получения готового продукта. Наиболее сложна и специфична аппаратура для ферментационной стадии. Технически наиболее сложным процессом ферментации является аэробный глубинный стерильный и непрерывный (или с подпиткой субстратом). Аппараты для поверхностной и анаэробной ферментации менее сложны и энергоемки. В современной литературе описаны сотни биореакторов, отличающихся по конструкции, принципу работы и размерам (от нескольких литров до нескольких тысяч кубометров). Многочисленность методов культивирование, чрезвычайное многообразие используемых биологических агентов привели к огромному разнообразию конструктивных решений, которые зависят от ряда факторов: типа продуцента и среды, технологии и масштабов производства, а также целевого продукта и пр. Техническое оснащение биотехнологии базируется на общих положениях технической биохимии и пищевой технологии, однако имеет свою специфику. Принципиальное отличие биотехнологических процессов от чисто химических заключается в следующем:

–чувствительность биологических агентов к физико-механическим воздействиям;

–наличие межфазового переноса веществ (по типу «жидкость – клетки», «газ – жидкость – клетки»);

–требования условий асептики;низкие скорости протекания многих процессов в целом;

–нестабильность целевых продуктов;

–пенообразование;

–сложность механизмов регуляции роста и биосинтеза.

 

 

Рисунок 11 - Схемы биореакторов для проточного культивирования микроорганизмов. А – хемостат; Б – турбидостат с автоматической регуляцией оптической плотности. 1 – поступление среды, 2 – мешалка, 3 – сток культуры, 4 – насос, 5 – фотоэлемент, 6 – источник света.

 

4. Стадии разработки биотехнологического производства: лабораторный регламент, опытно-промышленные испытания, промышленное производство, масштабирование.- тема для самостоятельной работы студента.

 

Вопросы для самопроверки

 

1. Основные стадии и показатели роста микроорганизмов

2. Виды биореакторов

3. Периодическое и непрерывное культивирование

4. Хемостат, турбидостат, оксистат

4. Стадии разработки биотехнологического производства

5. Лабораторный регламент

6. Опытно-промышленные испытания

7. Промышленное производство

8. Масштабирование

9. Схемы биореакторов для проточного культивирования микроорганизмов

10. Схема тубулярного биореактора полного вытеснения

11. Схема биореактора периодического действия

12. Ферментеры с подводом энергии газовой фазой

13. Ферментеры с вводом энергии жидкой фазой

14. Схема метановой установки

 

Лекция 7. Виды продуктов микробиологического синтеза. Препараты, содержащие жизнеспособные микроорганизмы; инактивированные клетки и продукты их переработки на основе продуктов метаболизма микроорганизмов

 

Форма проведения лекции: мозговая атака

 

План лекции

 

1. Виды продуктов микробиологического синтеза

2. Препараты, содержащие жизнеспособные микроорганизмы

3. Препараты, содержащие инактивированные клетки

4. Препараты, содержащие продукты переработки на основе продуктов метаболизма микроорганизмов

 

1. Ассортимент продуктов, получаемых в биотехнологических процессах, чрезвычайно широк. По разнообразию и объемам производства на первом месте стоят продукты, получаемые в процессах, основанных на жизнедеятельности микроорганизмов. Эти продукты подразделяются на три основные группы:

1 группа – биомасса, которая является целевым продуктом (белок одноклеточных) или используется в качестве биологического агента (био­метано­генез, бактериальное выщелачивание металлов);

2 группа – первичные метаболиты – это низкомолекулярные соединения, необходимые для роста микроорганизмов в качестве строительных блоков макромолекул, коферментов (аминокислоты, витамины, органические кислоты);

3 группа – вторичные метаболиты (идиолиты) – это соединения, не требующиеся для роста микроорганизмов и не связанные с их ростом (антибиотики, алкалоиды, гормоны роста и токсины).

Среди продуктов микробиологического синтеза – огромное количество различных биологически активных соединений, в том числе белковых и лекарственных веществ, ферментов, а также энергоносители (биогаз, спирты) и минеральные ресурсы (металлы), средства для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур (биоинсектициды) и биоудобрения. В связи с развитием новейших методов биотехнологии (инже­нерной энзимологии, клеточной и генной инженерии) спектр целевых продуктов непрерывно дополняется. Среди них все большее место занимают средства диагностики и лечения (гибридомы, моноклональные антитела, вакцины и сыворотки, гормоны, модифицированные антибиотики).

Конечным продуктом стадии ферментации является культуральная жидкость, содержащая суспензию микроорганизмов. Культуральные жидкости обычно являются сложными смесями большого числа компонентов, многие из которых обладают близкими физико-химическими свойствами. Наряду с растворенными минеральными солями, углеводами, белками и другими органическими веществами культуральные жидкости содержат в значительном количестве полидисперсные коллоидные частицы и взвеси. Следовательно, они являются не только многокомпонентными растворами, но и суспензиями. Дисперсная фаза этих суспензий состоит из мицелия или клеток микроорганизмов, а также из твердых частиц, содержащихся в большинстве питательных сред - муки, хлопьев из кукурузного экстракта и т.п. Характерной особенностью культуpaльных жидкостей является сравнительно низкое содержание целевых продуктов. Например, содержание биомассы при производстве дрожжей составляет 5 - 10 %, а при производстве бактериальных препаратов не превышает 1 - 2 %. Большинство целевых продуктов микробиологического синтеза нестабильны и подвержены влиянию различных факторов. Белки, например, исключительно чувствительны к нагреванию, изменению рН среды, ко многим физическим и химическим воздействиям.

При разработке технологии выделения целевых продуктов необходимо учитывать не только физико-химические свойства культуральных жидкостей, низкую концентрацию целевого продукта в них и его лабильность, но и вид готовой товарной формы биопрепарата. Все товарные формы биопрепаратов с точки зрения технологий их получения можно разделить на три основные группы.

Первая группа - биопрепараты на основе инактивированной биомассы клеток и продуктов переработки (кормовые дрожжи, грибной мицелии и др.).

Вторая группа - биопрепараты на основе очищенных продуктов метаболизма микроорганизмов (витамины, аминокислоты, ферменты, антибиотики и др.).

Третья группа - на основе жизнеспособных микроорганизмов (средства защиты растений, бактериальные удобрения, закваски для силосования кормов и др.).

Выбор товарной формы биопрепаратов зависит от свойств продукта, удобства применения, сохранения биологических свойств при хранении и транспортировке и т. д. Целевым продуктом микробиологического синтеза может быть, либо сама биомасса микроорганизмов (инактивированная или живые клетки), либо продукты метаболизма, растворенные в культуральной жидкости или находящиеся внутри клеток. Выделение инактивированной биомассы для получения биопрепартов первой группы отличается наиболее простой технологией и заключается в концентрировании культуральной жидкости (или выделенной из нее биомассы) и сушке. Технология выделения продуктов на основе метаболитов строится в зависимости от того, находится ли целевой продукт в культуральной жидкости или внутри клеток микроорганизмов. В первом случае используются такие методы, как экстракция, ионный обмен, адсорбция, кристаллизация. Когда целевой продукт находится внутри клеток, то либо используют метод экстракции, либо выделяют целевой продукт после дезинтеграции (разрушения) клеточной стенки.

Выделение жизнеспособных микроорганизмов для получения биопрепаратов третьей группы. Очень часто выделить целевой продукт с помощью одного метода практически невозможно. Поэтому применяют комбинацию нескольких методов.

Выделение инактивированной биомассы. В настоящее время многие биопрепараты производят в виде так называемых микробиологических концентратов. Основная часть микробиологических концентратов используется в качестве обогатительных добавок к кормам сельскохозяйственных животных (кормовой белок, кормовые антибиотики, аминокислоты, ферменты). Микробиологические концентраты представляют собой высушенные до определенной влажности культуральные жидкости. Следовательно, они содержат биомассу микроорганизмов, продукты их метаболизма, остатки компонентов питательных сред, пеногасители и т. д.

В некоторых случаях при получении концентратов возникает необходимость культуральную жидкость обработать тем или иным способом с целью концентрирования целевого вещества или выделения нежелательного компонента. Получение микробиологических концентратов по сравнению с другими биопрепаратами на стадии выделения конечного продукта отличается наиболее простой технологией. Общим для всех микробиологических концентратов является удаление воды полностью или частично. Основные технологические операции при получении концентратов - это упаривание и сушка.

 

 

Вопросы для самопроверки

 

1. Конечный продукт стадии ферментации

2. Ассортимент продуктов, получаемых в биотехнологических процессах

3. Характерная особенность культуpaльных жидкостей

4. Технология выделения продуктов на основе метаболитов

5. Культуральные жидкости

6. Микробиологические концентраты

7. Виды продуктов микробиологического синтеза.

8. Препараты, содержащие жизнеспособные микроорганизмы.

9. Препараты, содержащие инактивированные клетки

10.Препараты, содержащие продукты переработки на основе продуктов метаболизма микроорганизмов

 

 

Лекция 8. Методы выделения и очистки конечных продуктов. Методы высокой очистки – тонкослойная хроматография, электрофорез и т.д. Приготовление готовых форм – таблетирование, ампулирование, фасовка и т.п.

Заключение.

 

Форма проведения лекции: заключительная, проблемная

 

План лекции

Методы выделения и очистки конечных продуктов.

Флотирование

Сепарирование

Термообработка и упаривание

Фильтрование

Выделение продуктов в зависимости от вида целевого биопрепарата

Контроль и управление биотехнологическими процессами;

9 Методы высокой очистки – тонкослойная хроматография, электрофорез и т.д. 10 Приготовление готовых форм – таблетирование, ампулирование, фасовка и… 11 Заключение.

В микробиологической промышленности широко распространен процесс упаривания как один из способов предварительного концентрирования целевых продуктов. Упаривание проводится в одно- или многокорпусной вакуум-выпарной установке. В многокорпусных вакуум-выпарных установках происходит мно­гократное упаривание культуральной жидкости, поступающей последова­тельно из одного аппарата в другой. Целевые продукты биосинтеза в основном неустойчивы к нагреванию (термолабильны) и могут в определенной степени инактивироваться при температурах 50 - 60°C в течение 5 - 15 мин. Поэтому процесс упаривания следует проводить при режимах, обеспечивающих минимальные потери биологической активности конечных продуктов. Для каждого конкретного продукта опытным путем определяется время пребывания в вы­парном аппарате при соответствующей температуре.Для упаривания культуральных жидкостей принята темпе­ратура 70 – 75 оС. Такая температура кипения достигается пу­тем создания соответствующего разрежения в выпарных аппаратах.

Выпарной аппарат, показанный на рисунке, работает по принципу нисходящего потока. Культуральная жидкость из приемного бака насосом подается в верхнюю часть испарителя, где равномерно распределяется по верхней трубной решетке и стекает в виде тонкой пленки по внутренней поверхности труб. В межтрубное пространство пер­вого испарителя подается свежий греющий пар. Образующийся при испарении культуральной жидкости пар, так называемый вторичный пар, стекает в том же направлении, что и жидкостная пленка по трубам, а затем поступает в отделитель жидкости. Здесь происходит отделение упаренной жидкости от вторичного пара. Вторичный пар с температурой 80 - 87 °С направляется в межтрубное пространство второго испарителя.

Сгущенная культуральная жидкость из нижней части первого испарителя и отделителя насосом направляется на вто­рую ступень упаривания, а затем на третью.

  Рисунок 13 - Трехкорпусная выпарная установка: 1 - испаритель; 2 – брызгоотделитель; 3- труба вторичного пара; 4 - испаритель II ступени; 5 - испаритель III ступени; 6 - поверхностный конденсатор; 7 –насосы; 8 - водокольцевой вакуум-насос.

 

 

5 В производстве некоторых биологически активных веществ, в частности антибиотиков, для отделения массы микроорганиз­мов от культуральной жидкости применяют метод фильтрова­ния. Этот метод служит для отделения микроорганизмов-про­дуцентов, которые имеют нитевидную, ветвистую форму. Сущность фильтрования заключается в разделении твердой и жидкой фаз при пропускании культуральной жидкости через пористую перегородку. Движущей силой фильтрования явля­ется разность давлений по обе стороны перегородки. Одной из важнейших характеристик процесса фильтрования является его скорость, т. е. количество фильтрата, получаемого с единицы фильтрующей поверхности в единицу времени- W м3/(м2с):

где V-объем фильтрата (м3); F- площадь фильтрующей поверхности (м2); τ-время (с).

Скорость фильтрования зависит от давления, толщины слоя осадка, его структуры, вязкости жидкой фазы и других факторов. Фильтруемость культуральной жидкости зависит от вида микроорганизма-продуцента, качественного и количественного состава питательной среды, условий ферментации. Продуценты отличаются размерами и структурой клеточных образований. Например, продуцент пенициллина образует длинноволокнистый мицелий с «толстыми» нитями диаметром 5 - 10 мкм, отделение которого от жидкой фазы не представляет затруднений. Мицелий же актиномицетов характеризуется тонкими (0,2 - 1 мкм) ветвистыми нитями. К концу ферментации наблюдается значительный лизис клеток, в результате которого в жидкости образуется тонкодисперсная фракция взвеси, состоящая из обрывков мицелиальных клеток. Мицелий имеет аморфный, слизистый, липкий характер, быстро забивает поры фильтрующего материала. Удельное сопротивление осадка велико. Фильтрование этих культуральных жидкостей без предварительного улучшения фильтруемости практически невозможно. Для улучшения фильтруемости культуральные жидкости многих антибиотиков перед отделением мицелия подвергают специальной обработке. К способам улучшения фильтруемости культуральной жидкости относятся тепловая коагуляция, кислотная коагуляция, обработка жидкости электролитами и полиэлектролитами, образование наполнителя-коагулянта непо­средственно в жидкости, применение фильтровальных порошков. Тепловая коагуляция используется в основном для антибиотиков, которые не разрушаются при нагревании в водной среде. Основана она на денатурации белка при повышенной температуре. При этом скорость фильтрования увеличивается за счет свертывания и коагуляции белков, что приводит к образованию ими жестких структур, изменяющих характер (структуру) осадка. Осадок при этом делается менее липким, легко обезвоживается. Кроме того, при повышенной температуре (70 - 75°С) значительно уменьшается вязкость культуральной жидкости. Однако тепловая обработка обычно небла­гоприятно сказывается на качестве готового продукта. Кислотная коагуляция широко применяется в производстве антибиотиков, которые сравнительно устойчивы при низком значении рН раствора. Выбор кислоты для снижения рН определяется требованиями последующей химической очистки антибиотика. Однако кислотная коагуляция обеспечивает хорошую фильтруемость не для всех культуральных жидкостей. Хороший эффект в некоторых случаях дает совместная кислотно-тепловая коагуляция.

Широко практикуется для ускорения фильтрования культуральной жидкости применение фильтровальных порошков. Чаще всего используются силикатные порошки (перлит, диатомит и др.) или древесная мука. Порошок в виде водной суспензии подают на фильтр, нанося на его поверхность грунтовый (намывной) слой толщиной 1 - 2 мм., через который затем фильтруют культуральную жидкость. Благодаря высокой проницаемости грунтового слоя, скорость фильтрования увеличивается. Иногда порошки добавляют прямо в культуральную жидкость перед фильтрованием, однако в этом случае скорость фильтрования увеличивается всего на 15 – 20 %, в то время как с

      Рисунок 14 - Рамный фильтр- пресс: 1- лобовина, 2 – рама; 3-брус; 4 - подвижная лобовина; 5 - гидравлическое устройство; 7 – прилив; кран.

грунтовым слоем она выше в 1,5 - 2 раза. Перечисленные выше методы все же не являются достаточно эффективными. Они не позволяют изменить структуру осадка таким образом, чтобы можно было использовать для его отделения фильтры без намывного слоя.

Наиболее эффективным методом коагуляции, улучшающим характер осадка и повышающим скорость фильтрования, яв­ляется метод образования наполнителя непосредственно в культуральной жидкости при добавлении реагентов, образующих нерастворимый осадок. Такими реагентами служат соли Са, Ва, Fe, Al и др., образующие в водной среде осадки с анионами серной, фосфорной, щавелевой и других кислот. Выпадающие в культуральной жидкости осадки предотвращают слипание частиц мицелия, способствуют образованию гранул. Мицелий приобретает комковатую структуру и образует при фильтровании проницаемый слой. Фильтры для отделения биомассы от культуральной жидкости. По принципу работы различают фильтры периодического и непрерывного действия. По характеру движущей силы фильтры делятся на работающие под давлением и под вакуумом. Из множества конструкций фильтров для отделения мицелия в производстве биопрепаратов нашли применение лишь барабанные вакуум-фильтры и рамные фильтр-прессы.

Рамный фильтр-пресс, схема которого изображена на рисунке, относится к аппаратам периодического действия, работающим под давлением. Фильтр-пресс состоит из чередующихся плит - 2 и рам - 3 одинаковых размеров, между которыми зажата фильтрующая ткань (салфетки). Плиты и рамы опираются боковыми ручками на два параллельных круглых бруса - 4. Плиты и рамы плотно прижимаются к лобовине при помощи подвижной лобовины - 5, на которую действует давление плунжера гидравлического устройства - 6.

Плиты имеют по краям гладкую поверхность, а в середине - рифленую с желобками. Плиты и рамы имеют приливы - 7 с отверстиями, которые при сборке образуют канал для под­вода фильтрующей жидкости.

Процесс фильтрования на рамном фильтр-прессе осуществляется следующим образом. Культуральная жидкость под давлением подается в канал и из него через отверстия в стенке рамы поступает во внутреннюю полость (пространство), ограниченную двумя фильтровальными перегородками и внутренней поверхностью рамы. Мицелий задерживается в этом пространстве, а нативный раствор проходит через фильтрующие салфетки, после чего по желобам и каналам через краны стекает в лоток. Обычно первые порции фильтрата бывают мутными, их возвращают в сборник культуральной жидкости. В дальнейшем на ткани накапливается слой осадка, через который осуществляется фильтрование. Фильтрат становится при этом прозрачным.

Рисунок 15 - Схема работы барабанного вакуум – фильтра: I –фильтрование; II-просушка; III- промывка и просушка; IV- отдувка и регенерация ткани

 

После фильтрования осуществляют промывку мицелия. Цель промывки - вытеснить нативный раствор из осадка, чтобы обеспечить более полный переход. По окончании промывки мицелий на фильтре продувают сжатым воздухом для вытеснения промывных вод из пор осад­ка. Затем отодвигают подвижную плиту, разъединяют плиты и рамы и осадок удаляют в бункер, а фильтрующие полотна промывают струями воды. Проведение процесса фильтрования с постепенным повыше­нием давления от 0 до 0,2 - 0,3 мПа обеспечивает более высокую производительность фильтра, чем в случае фильтрования при постоянном высоком давлении. Высокое давление в начальный момент фильтрования вызывает проникновение мелких частиц осадка в поры грунтового слоя в фильтрующей ткани, что приводит к их забиванию и снижению скорости фильтрования. Недостатки рамного фильтр-пресса заключаются в больших затратах физического труда, тяжелых в санитарном отноше­нии условиях работы обслуживающего персонала и значительном снижении скорости фильтрования во времени. К преимуществам рамного фильтр-пресса можно отнести большую поверхность фильтрования на единицу занимаемой фильтром площади помещения, простоту конструкции, отсутствие движущихся частей, а также возможность получения про­зрачного фильтрата.

Барабанный вакуум-фильтр представляет собой фильтр непрерывного действия, работающий под вакуумом. Фильтр имеет горизонтальный перфорированный барабан, покрытый снаружи фильтрующей тканью.

 

 

6. Как было сказано выше, конечным продуктом стадии ферментации является культуральная жидкость, содержащая суспензию микроорганизмов. Культуральные жидкости обычно являются сложными смесями большого числа компонентов, многие из которых обладают близкими физико-химическими свойствами. Наряду с растворенными минеральными солями, углеводами, белками и другими органическими веществами культуральные жидкости содержат в значительном количестве полидисперсные коллоидные частицы и взвеси. Следовательно, они являются не только многокомпонентными растворами, но и суспензиями. Дисперсная фаза этих суспензий состоит из мицелия или клеток микроорганизмов, а также из твердых частиц, содержащихся в большинстве питательных сред - муки, хлопьев из кукурузного экстракта и т.п. Характерной особенностью культуpaльных жидкостей является сравнительно низкое содержание целевых продуктов. Например, содержание биомассы при производстве дрожжей составляет 5 - 10 %, а при производстве бактериальных препаратов не превышает 1 - 2 %. Большинство целевых продуктов микробиологического синтеза нестабильны и подвержены влиянию различных факторов. Белки, например, исключительно чувствительны к нагреванию, изменению рН среды, ко многим физическим и химическим воздействиям. При разработке технологии выделения целевых продуктов необходимо учитывать не только физико-химические свойства культуральных жидкостей, низкую концентрацию целевого продукта в них и его лабильность, но и вид готовой товарной формы биопрепарата. Выбор товарной формы биопрепаратов зависит от свойств продукта, удобства применения, сохранения биологических свойств при хранении и транспортировке и т. д. Целевым продуктом микробиологического синтеза может быть, либо сама биомасса микроорганизмов (инактивированная или живые клетки), либо продукты метаболизма, растворенные в культуральной жидкости или находящиеся внутри клеток. Получение микробиологических концентратов по сравнению с другими биопрепаратами на стадии выделения конечного продукта отличается наиболее простой технологией. Общим для всех микробиологических концентратов является удаление воды полностью или частично. Основные технологические операции при получении концентратов - это упаривание и сушка.

Технология упаривания культуральной жидкости изложена в предыдущем разделе. В данном разделе рассмотрим процесс сушки биомассы на примере производства белково-витаминного концентрата (БВК) на парафинах нефти. Для получения белковых препаратов, пригодных к длительному хранению и транспортировке, биомассу клеток необходимо высушить до влажности 8- 10%. В более влажном состоянии масса микроорганизмов быстро теряет ценные биологически активные вещества и начинает разлагаться.

Клеточная суспензия после упаривания с содержанием сухих веществ 15 – 20% подвергается сушке в специальных сушильных установках.

 

 

 

Рисунок 16 - Двухвальцовая паровая сушилка непогруженного типа: 1- продольный шнек; 2 – нож; 3-клинья; 4 –барабаны; 5крышки; 6 - труба для вывода конденсата.  

 

 

Вальцовые сушилки применяются на предприятиях малой мощности. Процесс сушки в таких аппаратах происходит в результате соприкосновения суспензии биомассы с горячей поверхностью вращающегося барабана. По конструкции эти сушилки бывают одно- и двухвальцовые, непогруженные и погруженные. Двухвальцовая сушилка не погружного типа ВСГ состоит из двух стальных полых горизонтально расположенных барабанов. В барабаны, которые закрыты с торцов крышками, подается пар. Барабаны монтируются строго параллельно. У торцов барабанов сверху устанавливаются клинья, образующие между барабанами ванну, в которую непрерывно поступает концентрат биомассы.

Рисунок 17 - Двухвальцовая паровая сушилка погружного типа: 1 – сборник; 2 – нож; 3 – барабаны; 4 – ванны; 5 – мешалки; 6 - теплообменник.

Концентрат биомассы нагревается в ванне до температуры около 100°С и часть воды при этом испаряется. При вращении барабанов навстречу друг другу клеточная биомасса намазывается на их поверхность тонким слоем и высушивается до влажности 8 - 10%. Сухая биомасса снимается с поверхности барабанов ножами и осыпается в продольные шнеки, откуда подается па фасовку.

Двухвальцовая сушилка погружного типа СДА 1200/3600 отличается от описанной выше тем, что в ней сушильные барабаны погружены в ванну с клеточной суспензией и работают самостоятельно. Суспензия в ванне перемешивается мешалкой, а перед подачей в ванну подогревается в теплообменнике. Потери белка на вальцовых сушилках достигают 15%.

Распылительные сушилки применяются в производстве многих продуктов микробиологического синтеза. Они различаются способом взаимодействия высушиваемого материала с сушильным агентом (прямоточные, противоточные или смешанные), температурой и составом газа-носителя, устройством распылительного механизма и т. д.

Наиболее производительными являются распылительные су­шилки, применяемые для сушки кормовых дрожжей. На рисунке представлена схема распылительной сушилки с центробежным распылением и с нижним подводом сушильного агента.

  Рисунок 18 - Сушилка с центробежным распылением: 1 - центробежный распылительный механизм; 2 - направляющий аппарат; 3 - газопроводник теплоносителя; 4 - сушильная камера; 5 - затвор для сбора продукта; 5 - труба пневмотранспорта.

Дрожжевая суспензия непрерывно подается под небольшим давлением в распылительный механизм, который представляет собой диск с лопастями. Под действием центробежной силы, возникающей при вращении диска, раствор в виде пленки перемещается с непрерывно возрастающей скоростью к периферии диска и сбрасывается в виде струек, распадающихся на мельчайшие капли размером 60 - 70 мкм. Сушильный агент (нагретый воздух или дымовые газы, разбавленные воздухом) подается в сушильную камеру по газопроводу, который заканчивается направляющим аппаратом. При помощи направляющего аппарата создается большая скорость движения теплоносителя на входе в сушильную камеру и одновременно сообщается спиралеобразное направление движению теплоносителя. Начальная температура сушильного агента при сушке кормовых дрожжей достигает 300 - 350 °С. Распыленная дрожжевая суспензия, вступая в контакт с теплоносителем, теряет воду - высушивается. Испарение воды из дрожжевой суспензии при высокой степени распыления протекает практически мгновенно, благодаря чему сушильный агент быстро охлаждается и температура его на выходе из сушилки не превышает 100 °С. Высушенные дрожжи также не прогреваются выше этой температуры. Сухие кормовые дрожжи в виде порошка падают в нижнюю конусную часть сушилки, откуда непрерывно удаляются. Отработанный теплоноситель отводится из сушильной камеры. Часть дрожжей (15 – 20 %) уносится вместе с теплоносителем и для их улавливания устанавливаются специальные пылеулавливающие аппараты - циклоны. Сухие дрожжи из-под конуса сушилки и из циклонов подаются пневмотранспортом на фасовку и упаковку. Распылительные сушилки являются весьма сложными и небезопасными устройствами в эксплуатации, поэтому их работу стремятся автоматизировать. Автоматическое управление процессом сушки позволит интенсифицировать процесс сушки, повысить качество получаемого продукта, сократить удельные расходы топлива и энергии.

Выделение продуктов метаболизма из культуральной жидкости

Если биологически активное вещество, например антибиотик, находится в культуральной жидкости в растворенном состоянии, то для извлечения его применяют экстракцию или ионообменный метод.

Метод жидкостной экстракции

Жидкостная экстракция представляет собой процесс извлечения веществ одной жидкостью из другой. Из воды вещество экстрагируют органическим растворителем, а из органического растворителя - водой. Обычно используют такой органический растворитель, который не смешивается с водой. Таким образом, в процессе экстракции участвуют две жидкие фазы - экстрагент и исходный раствор. Получаемые после экстракции фазы называются экстрактом и рафинатом (или отработанным раствором). Метод экстракции позволяет не только извлечь целевой компонент из культуральной жидкости, но и отделить его от значительного числа сопутствующих примесей и сконцентрировать. Для экстракции к определенному объему водного раствора вещества, например, антибиотика, прибавляют определенный объем органического растворителя (экстрагента), нерастворимого или слаборастворимого в воде. Водную и органические фазы перемешивают и затем разделяют отстаиванием или центрифугированием. В результате получают экстракт и отработанный раствор. В лабораторной практике экстракцию проводят в делительных воронках. Основной характеристикой процесса экстракции является коэффициент распределения Кр, который представляет собой отношение равновесной концентрации распределяемого вещества в органической фазе Со (экстракте) к его равновесной концентрации в водной фазе Св (рафинате).:

По значению коэффициента распределения судят об экстракционной способности экстрагента. Чем выше КР, тем выше способность данного экстрагента извлекать целевой компонент. Количество извлеченного вещества увеличивается с ростом продолжительности экстракции. Однако для многих биологиче­ски активных веществ, лабильных в процессе экстракции, время экстракции необходимо сокращать. Кроме того, переработка больших объемов культуральной жидкости (десятки тонн) также требует уменьшения продолжительности экстракции. Для того чтобы увеличить скорость процесса экстракции, необходимо максимально развить поверхность взаимодействия между фазами. Это может быть достигнуто интенсивным диспергированием экстрагента на мелкие капли с равномерным распределением их в другой

 

 

Рисунок 19 - Струйный инжектор – сместитель: 1- сопло; 2 – отверстия; 3 – штуцер; 4 -всасывающий трубопровод.

 

жидкости. При этом не только возрастает площадь поверхности соприкосновения фаз, но и значительно уменьшается сопротивление переходу извлекаемого вещества. Увеличению скорости процесса экстракции способствует также создание противоточного движения жидкостей. В этом случае еще не содержащий целевого компонента экстрагент контактирует с обедненным раствором, тогда как при прямотоке насыщенный целевым компонентом экстрагент контактирует с исходным раствором. Большинство культуральных жидкостей содержат белки, высшие амины, соли жирных кислот, которые являются эмульгаторами. При диспергировании экстрагента и культуральной жидкости образуется стойкая эмульсия, неполное разделение которой приводит к потере как целевого компонента, так и растворителя. Наиболее эффективно разрушение эмульсии происходит под действием центробежных сил. Длительность разрушения эмульсии должна быть минимальной (не более 10 с.). Поэтому экстракцию, например, антибиотиков проводят либо в центробежных экстракторах-сепараторах, в которых одновременно осуществляются процесс экстракции и разрушение образовавшейся эмульсии, либо и две стадии - в одном аппарате - процесс экстракции, а в центробежных сепараторах или суперцентрифугах - разделение эмульсии.

На заводах малой производительности применяют периодическую экстракцию, которую проводят в аппарате с мешалкой и коническим днищем типа делительной воронки. Аппарат снабжен рубашкой для охлаждения. В аппарат заливают определенные объемы культуральной жидкости и экстрагента, включают мешалку и приливают раствор кислоты или шелочи до установления требуемого значения рН. Перемешивают в чеченце 10 - 20 мин., выключают мешалку затем разделяют водную и органическую фазы под действи­ем силы тяжести или сепарацией. На заводах, где перерабатываются десятки и сотни тонн культуральной жидкости в сутки применяется непрерывная экстракция. Культуральную жидкость и органический растворитель из емкостей непрерывно подают насосами в определенных количествах на смешение в смеситель-экстрактор. Полученная в смесителе эмульсия для разделения направляется в тарельчатые сепараторы или трубчатые сверхцентрифуги.

Аппараты для экстракции

При раздельных процессах экстракции и сепарирования чаше всего используют струйный cместитель – инжектор, в котором достигается тонкое диспергирование жидкостей. Конструкция таких смесителей проста и удобна, так как отсутствуют движущиеся части. Сепаратор специально разработан для производ­ства антибиотиков. Эмульсия подается в сепаратор сверху, проходит через отверстия тарелкодержателя и поступает в камеру барабана, где находится комп­лект разделительных тарелок. В тарелках имеется два концентрических ряда отверстий, проходя через которые жидкость заполняет межтарелочные зазоры. При вращении ротора сепаратора с частотой 4000 - 7000 об/мин создается центробежная сила, под действием которой более тяжелая жидкость отбрасывается к периферии барабана, стекая вниз по тарелкам, а легкая поднимается вдоль тарелок.

Рисунок 20 - Схема работы тарельчатого барабана сепаратора при разделении эмульсий

Тяжелая жидкость, поднимаясь по периферии барабана, огибает верхнюю разделительную тарелку (горловину) и через отверстия в крышке непрерывным потоком выводится из барабана. Легкая фракция выходит из барабана через кольцевой зазор между тарелкодержателем и горловиной.

Трубчатая сверхцентрифуга также предназначена для разделения эмульсии, получаемой в смесителе. Основным ее элементом является полый цилиндр - ротор, вращающийся с частотой 13000 - 15000 об/мин. Разделяемая эмульсия поступает в ротор снизу. Поднимаясь вдоль вращающегося ротора, она приводится в интенсивное вращение и расслаивается под действием центробежной силы. При этом жидкость, обладаю­щая большей плотностью (тяжелая), движется по периферии барабана, а жидкость с меньшей плотностью (легкая) - по его центральной зоне. В верхней части центрифуги имеется два приемника, через которые непрерывно отводятся тяжелая и легкая фракции разделенной смеси.

Применение экстракционных установок непрерывного действия, состоящих из одного смесителя и одного сепаратора, т. е. осуществляющих одноступенчатую экстракцию, часто не обеспечивает достаточной степени извлечения вещества. Для умень­шения потерь антибиотика с отработанным раствором осуще­ствляют многократную (многоступенчатую) противоточную экстракцию. В этом случае экстракцию проводят в многоступенчатых центробежных экстракторах-сепараторах, в которых одновременно происходит как смешение жидкостей, так и их сепарирование. Выделенный из культуральной жидкости методом экстракции продукт поступает на экстракцию, т. е. его переводят из органического растворителя в воду. Дальнейшее концентрирование антибиотика, его очистка и выделение осуществляются химическими методами.

Ионообменный метод

Ионообменный метод является одним из эффективных способов выделения биологически активных веществ из культуральной жидкости. Этот метод отличается рядом преимуществ перед другими методами: простота аппаратурного оформления многократное использование ионообменных смол, возможность осуществлении полной механизации и автоматизации техно­логического процесса, исключение контакта работающих с часто токсичными полупродуктами, работа с водными растворами без применения вредных органических растворителей. Ионообменный метод основан на способности ионообменных смол сорбировать биологически активные вещества, благодаря эквивалентному обмену между ионами вещества, находящегося в растворе, и ионами сорбента. Ионообменные смолы, или иониты, представляют собой синтетические высокомолекулярные органические вещества трехмерной структуры, практически нерастворимые в воде и органических растворителях. Иониты содержат обменные ионы, называемые подвижными или противоионами, которые связаны с противоположно заряженным ионом, называемым фиксированным или анкерным. Иониты с положительно заряженными противоионами называют катионитами. Иониты с отрицательно заряженными противоионами называют анионитами. Кроме того, существуют и амфотерные иониты, которые содержат катионо- и анионоименные группы, обладая, таким образом, двойственными функциями. При введении ионита в неорганическую или органическую жидкость происходит более или менее значительная сольватация противоионов и фиксированных ионов с одновременным увеличением объема, т. е. набухание полимера. Но трехмерная структура ионитов ограничивает их способность к набуханию. Набухший ионит можно сравнить с губкой, характеризующейся чередованием сгущений и разрежений. Через такую структуру, которую называют пространственной сеткой, осуществляется движение обменивающихся ионов. Ионит должен быть проникаем как для сорбируемых, так и для десорбируемых ионов. В соответствии со способом получения иониты подразделя­ют на полимеризационные и поликонденсационные. Как в тех, так и в других матрица состоит из длинных продольных цепей, соединенных между собой поперечными мостиками, называемыми химическими узлами. Продольные цепи могут механически переплетаться, образуя физические узлы. Увеличение или уменьшение числа химических и физических узлов влияет на размер микропор ионитов, а, следовательно, и на их проницаемость.

Основной характеристикой обменной способности ионита является полная обменная емкость выражаемая как число обменных групп в миллиграмм-эквивалентах (мг-экв.), приходящихся на 1 г ионита. В отличие от экстракционного метода, при котором целевой компонент переходит из одной жидкости в другую, сорбционный метод основан на массообмене между жидкой и твердой фазами. Ионообменное извлечение может быть осуществлено тремя способами: статическим, динамическим и хроматографическим.

Статический способ заключается в смешении и последующем разделении ионита и обрабатываемого раствора. Процесс проводится в емкостном аппарате, снабженном мешалкой для суспензирования ионита в растворе. По окончании сорбцииионит, содержащий целевой компонент, например антибиотик, отделяют от маточного раствора на фильтре, промывают водой и возвращают в аппарат. В аппарате проводят таким же образом извлечение антибиотика. Статический спо­соб применяют главным образом в лабораторной практике. Наиболее распространенным при ионообменном выделении антибиотиков стал динамический способ. Он заключается в пропускании раствора через слой ионита в одном направлении. По мере движения раствор «обедняется» сорбируемыми ионами, а контактирует с активными (с точки зрения ионообменной способности) слоями ионита. При этом протекающий раствор уносит с собой продукты ионообменной реакции, т. е. вытесненные ионы. Благодаря этому достигается практически полное извлечение антибиотика из раствора и постепенное на­сыщение слоя ионита. Выделение антибиотика из сорбента в динамических условиях позволяет достичь полной десорбции антибиотика и получать высокоактивные (концентрированные) растворы. Ионообменная хроматография применяется преимущественно в исследовательских работах для более четкого отделения антибиотика от других соединении, сорбируемых ионитом.

Аппараты для ионного обмена

Основным аппаратом для осуществления динамического ионного обмена является ионитовый фильтр, представляющий собой вертикальный цилиндри­ческий сосуд, заполненный ионитом, через слой которого протекает обрабатываемая жидкость. Фильтры изготавливаются из углеродистой стали, а также из винипласта, стекла, плек­сигласа. Так как высота фильтров обычно гораздо больше их диаметра, то их называют ионообменными колоннами. В производстве антибиотиков встречаются два типа ионообменных фильтров: закрытый (напорный) и открытый (безнапорный). Закрытый фильтр представляет собой герме­тичную конструкцию, рассчитанную на работу под напором пртекаюшей через него жидкости, т. е. на избыточное внутренние давление. У днища внутри фильтра устанавливается диск с отверстиями, в которые ввинчиваются колпачки. На диск загружается ионообменная смола. Колпачки имеют щелевидные прорези шириной 0,2 - 0,3 мм. Жидкость при движении в колоне сверху вниз проходит сквозь прорези, а зерна ионита, размеры которых превосходят ширину щели, задерживаются в колонне. В верхней части фильтра имеется устройство для распределения жидкости при движении ее сверху и отвода жидкости при промывке, когда промывная жидкость подается снизу. Распределительное устройство представляет собой крестовину, состоящую из винипластовых трубок-лучей с отверсти­ями, обеспечивающими равномерность поступления или отвода жидкости.

Практика использования напорных фильтров с верхней подачей растворов выявила наличие в их работе ряда существенных недостатков, вызванных тем, что слой ионита в таком фильтре фактически неподвижен и сжат давлением нагнетаемой жидкости. Это приводит к слипанию частиц ионита, образованию каналов, через которые проходит значительная часть жидкости. Таким образом, не все зерна и не вся поверхность отдельных зерен участвуют в ионообменном процессе, что, ес­тественно, уменьшает производительность колонны и снижает полноту извлечения. Кроме того, возникает опасность инфицирования фильтров микрофлорой в застойных участках слоя.

Рисунок 21 - Ионитовые фильтры: а - закрытый (напорный), б - открытый (безнапорный): 1- корпус фильтра; 2- распределительное устройство для жидкости; 3- ионит; 4- колпачки; 5- слой зернистого материала.

Открытый фильтр не имеет этих недостатков. Нативный раствор подается в этом фильтре снизу со скоростью, при которой зерна ионита поддерживаются во взвешенном в жидкости состоянии (псевдоожиженный, или «кипящий» слой). При этом каждое зерно ионита омывается раствором со всех сторон и ионит используется более эффективно. Отвод из колонны жидкости, подаваемой снизу, осуществляется через патрубок. Верхняя, расширенная часть колонны предназначена для осаждения мелких частиц ионита под действием силы тяжести, т. е. выполняет функцию отстойника. Оседанию взвеси способствует уменьшение скорости потока при его расширении вo время движения через коническую часть осадителя и изменение направления шлака при переливе жидкости через борт в кольцевой карман. Частицы ионита, осевшие не в кармане, возвращаются в колонну через переливной патрубок.

Выделение продуктов метаболизма из биомассы клеток

Целевым продуктом микробиологического синтеза могут быть внутриклеточные биополимеры (белки, липиды, нуклеи­новые кислоты), а также метаболиты (ферменты, антибиотики и т. д.). Некоторые из них можно выделить, не разрушая клеточной стенки, а для извлечения других необходимо провести предварительно дезинтеграцию (разрушение) клеточной оболочки.

Экстракция из клеточной массы

Для выделения внутриклеточных антибиотиков проводят дезинтеграцию клеточных оболочек. Дезинтеграция может быть осуществлена химическими,… Биологические способы разрушения клеточной оболочки ос­нованы на действии… Физическая дезинтеграция - это процесс механического воздействия на клетку, который сопровождается быстрым…

Сублимационная сушка

Подготовка биомассы. Сублимационной сушке подвергают концентрат суспензии микроорганизмов, полученный из культуральной жидкости одним из… Замораживание Замораживание - наиболее ответственный этап в технологии сублимационной сушки продуктов микробиологического синтеза.…

Методы выделения и очистки конечных продуктов

Флотирование

Сепарирование

Термообработка и упаривание

Фильтрование

Выделение продуктов в зависимости от вида целевого биопрепарата

Контроль и управление биотехнологическими процессами

Приложения   Проблемные вопросы к лекциям

– Конец работы –

Используемые теги: основы, биотехнологического0.039

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным для Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Еще рефераты, курсовые, дипломные работы на эту тему:

Основы планирования. Теоретические основы управления проектами. Основы планирования. Планирование проекта в MS Project 7
Использованная литература В В Богданов Управление проектами в Microsoft Project Учебный курс Санкт Петербург Питер г...

Ведение в курс "Основы экономической теории" (Введення в курс "Основи економiчної теорiї)
В працях Ксенофонта 430 355 рр. до н. е Платона 427 347 рр. .о н. Аристотеля 384 322 рр. до н. е а також мислителв стародавнього Риму, нд, Китаю… Але не кожна економчна думка розвиваться у систему поглядв ста економчним… Н в рабовласницькому, н у феодальному суспльств ще не снувало струнко системи економчних поглядв на економчн процеси.…

ОСНОВИ ТЕОРIЇ КIЛ, ОСНОВИ РАДІОЕЛЕКТРОНІКИ
МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ... ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ РАДІОЕЛЕКТРОНІКИ...

Функциональные основы проектирования: антропометрия, эргономика и технология процессов, как основа назначения основных габаритов здания
Семестр... специальности Промышленное и гражданское строительство... Городское строительство и хозяйство Лекция Функциональные основы...

Логические основы работы ЭВМ. Основы понятия и операции алгебры логики
Введение... Логические основы работы ЭВМ Основы понятия и операции алгебры логики Прикладное программное обеспечение...

Экономические основы технологического развития тема “ Основы технологического и экономического развития”
Особенностью современного развития технологий является переход к целостным технолого-экономическим системам высокой эффективности, охватывающим… В практической деятельности экономиста и финансиста технология является… Именно за счет прибыли, полученной от своевременно и разумно вложенных в технологию средств, и достигается…

Истоки и теоретические основы паблик рилейшнз. Истоки и теоретические основы паблик рилейшнз (ПР)
Смоленский государственный университет... Н Н Розанова ПАБЛИК РИЛЕЙШНЗ Пособие к семинарским занятиям...

Модуль 1. ПРИРОДНИЧОНАУКОВІ ОСНОВИ УЯВЛЕНЬ ПРО НАВКОЛИШНЮ ДІЙСНІСТЬ Тема 1. Основи концепцій представлення детермінованої фізичної картини макросвіту
Тема Основи концепцій представлення детермінованої фізичної картини макросвіту... Лабораторная работа... Дослідження моделей геометричних і динамічних уявлень про об єкти...

Модуль 1. ЕСТЕСТВЕННОНАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ ОБ ОКРУЖАЮЩЕЙ ДЕЙСТВИТЕЛЬНОСТИ Тема 1. Основы концепций представления детерминированной физической картины мира
Модуль ЕСТЕСТВЕННОНАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ ОБ ОКРУЖАЮЩЕЙ ДЕЙСТВИТЕЛЬНОСТИ... Тема Основы концепций представления детерминированной физической картины... Из наблюдений установлять теорию через теорию исправлять наблюдения есть лучший способ к изысканию правды...

Деление клеток - основа размножения и роста организмов Деление клеток - процесс, лежащий в основе размножения и индивидуального развития всех живых организмов. Основную роль в делении клеток играет ядро. На окрашенных препаратах клетки содержимое ядра в
В процессе деления ядра нуклеопротеины спирализуются, укорачиваются и становятся видны а световой микроскоп в виде компактных палочковидных… Она в десятки раз продолжительнее митоза. В эту фазу происходит синтез молекул… В анафазе центромеры делятся, сестринские хроматиды отделяются друг от друга и за счет сокращения нитей веретена…

0.031
Хотите получать на электронную почту самые свежие новости?
Education Insider Sample
Подпишитесь на Нашу рассылку
Наша политика приватности обеспечивает 100% безопасность и анонимность Ваших E-Mail
Реклама
Соответствующий теме материал
  • Похожее
  • По категориям
  • По работам