Суть і особливості хроматографічних методів аналізу

Одне з важливих завдань сучасної аналітичної хімії – надійний і точний аналіз органічних та неорганічних речовин, часто близьких за будовою та властивостями.

Хроматографія – це велика область фізико-хімічних методів аналізу, яка поєднує в собі як способи концентрування і розділення, так і способи ідентифікації та кількісного визначення різноманітних речовин.

Хроматографічні методи посідають особливе місце серед ефективних методів аналітичного аналізу, оскільки дуже широко використовуються завдяки своїй універсальності – дозволяють провести аналіз складних неорганічних та органічних речовин, що перебувають у газуватому, рідкому і навіть твердому агрегатному стані. Новітніми хроматографічними методами можна проаналізувати газоподібні, тверді і рідкі речовини з молекулярною масою від 1 до 10⁶. Це один із найважливіших аналітичних методів.

Хроматографія – гібридний аналітичний метод, в якому поєднуються метод розділення і метод визначення.

На відмінність від інших методів, заснованих на розподілі компонентів між фазами, хроматографія – це динамічний метод, що забезпечує багатократність актів сорбції-десорбції компонентів, які розділяються, оскільки розділення відбувається в потоці рухомої фази. Цим обумовлена велика ефективність хроматографічного методу в порівнянні з методами сорбції і екстракції.

Найзагальніше визначення хроматографії– це фізико-хімічний метод розділення речовин, який ґрунтується на розподілі компонентів між двома фазами – нерухомою і рухомою.

Нерухома фаза – це твердий адсорбент із розвиненою поверхнею або плівка рідини, адсорбційно закріплена на твердому носії; функція нерухомої фази – сорбувати, утримувати речовини. Рухома фаза – потік газу або рідини, який проходить (фільтрується) крізь шар сорбенту, функція рухомої фази– розчиняти в собі речовини і переміщувати їх. Рухому фазу, що вводиться в шар нерухомої фази, називають елюентом, а рухому фазу, що виходить з колонки і містить розділені компоненти, – елюатом.

Компоненти аналізованої суміші (сорбат) разом з рухомою фазою пересуваються уздовж стаціонарної фази (сорбенту). Її зазвичай поміщають в скляну або металеву трубку, що називають колонкою.

Найпростіше уявлення про хроматографічне колонку таке: скляна чи металічна трубку, наповнена подрібненим сорбентом – речовиною, яка поглинає компоненти суміші, а просування рухомої фази (рідини чи газу) через шар нерухомої фази здійснюється за рахунок різниці тиску на кінцях цієї трубки.

У всіх випадках компоненти аналізованої суміші розподіляються між нерухомою і рухомою фазою. B залежності від сили взаємодії з поверхнею сорбенту (за яким-небудь механізмом) компоненти переміщаються уздовж колонки з різною швидкістю. Одні компоненти залишаються у верхньому шарі сорбенту, інші, з меншим ступенем взаємодії з сорбентом, знаходяться в нижній частині колонки, деякі покидають колонку разом з рухомою фазою. Таким чином компоненти розділяються.

Отже, розділення компонентів суміші на хроматографічній колонці зумовлене їх різним утримуванням у нерухомій фазі. Молекули утримуються в результаті дії міжмолекулярних сил притягання або так званих сил Ван-дер-Ваальса, які мають електростатичну природу та виникають між сорбентом і сорбатом.

Неоднаковий розподіл компонентів суміші між фазами створює умови, необхідні для їх розділення та подальшого визначення. Це призводить до утворення на виході з колонки окремих зон, кожна з яких містить компонент розділюваної суміші (рис. 1).

 

Рис.1.Розділення суміші з трьох компонентів (А, Б, В) на хроматографічній колонці (К) із детектором (Д)

а – розташування хроматографічних зон компонентів, що розділяються, у колонці через певні інтервали часу; б – хроматограма (С – сигнал детектора, t – час).

 

Завдання аналітика – виявлення цих зон і визначення їх якісного і кількісного складу.

Кожен вид хроматографії заснований на окремому, особливому фізичному процесі. Виникає питання, на якій підставі ці різні явища і методи розділення, засновані на різних принципах, об'єднуються в одну науку – хроматографію. Що є типовим для всіх хроматографічних методів, які вже відкриті або які ще будуть відкриті?

Всі сучасні хроматографічні методи володіють рядом загальних, причому дуже суттєвих рис. Характерними особливостями будь-яких хроматографічних методів є наступні:

· Висока роздільна здатність процесу розділення, зумовлена ​​високою ефективністю процесу, що дає можливість розділення навіть близьких за природою, структурою і властивостями речовин. Цим пояснюється широке розповсюдження хроматографії в різних галузях наукових досліджень, в лабораторній практиці, промисловості. Ті розділення, які до застосування хроматографічних методів не могли бути здійснені, стали легко здійснюваними після їх появи. Сюди відносяться, наприклад, розділення сумішей амінокислот на індивідуальні компоненти, розділення сумішей вуглеводнів на індивідуальні речовини, розділення сумішей рідкоземельних елементів на окремі елементи, виділення ферментів в чистому вигляді і багато інших розділень.

· М'які умови розділення. Можна порівняти процес хроматографічного розділення сумішей з процесом розділення складних сумішей методом перегонки, але якщо звичайна перегонка здійснюється, як правило, в досить жорстких умовах (висока температура, глибоке вакуумування), то хроматографічні розділення здійснюються в м'яких умовах (при атмосферному тиску, при звичайних температурах).

· Хроматографія – це процес динамічний, будь-яке хроматографічне розділення завжди полягає у переміщенні компонентів аналізованої проби рухомою фазою через шар нерухомої речовини.

· Відповідно, в будь-якому із варіантів хроматографічного методу обов’язкова наявність двофазової системи.

На основі вищевикладених особливостей хроматографії можна дати наступне повневизначенняхроматографічним методам:

Хроматографічним методом називається фізико-хімічний метод розділення сумішей, при якому компоненти розділюваної суміші розподілені між двома фазами, одна з яких є нерухомим шаром з великою поверхнею контакту, а інша фаза є потоком, який фільтрується через нерухомий шар. Слово ”фільтрується” – є відмінною рисою хроматографічного методу від інших фізичних методів розділення, які ґрунтуються на використанні двофазних систем (дистиляція, екстракція, де використовується протиточнийрух обох фаз).

Перелічимо основні завдання, які можуть бути вирішені за допомогою хроматографічних методів:

• якісний і кількісний аналіз складних сумішей речовин;

• розділення багатокомпонентних за складом сумішей на індивідуальні компоненти;

• концентрування речовин з їх дуже розбавлених розчинів. Цілі тут можуть бути різні: хроматографічні методи дозволяють сконцентрувати уран, що міститься в природних рудах в десятих, а то і сотих частках відсотка; сконцентрувати радій, що міститься в природних водах у концентраціях 10^-5-10^-6 г-атом/л. Може стояти завдання добування цінних металів (срібла, золота, платини) з розбавлених технологічних розчинів (гідрометалургія) або виробничих стічних вод (питання екології);

• очищення технічних продуктів від домішок, доведення цих продуктів до заданого ступеня хімічної чистоти, отримання чистих хімічних реактивів;

• контроль різних виробництв методами хроматографії;

• визначення молекулярної структури деяких сполук шляхом встановлення зв’язку між здатністю до сорбції і будовою даної речовини.

 

2.Основні етапи розвитку хроматографії (на самостійне опрацювання)

Запропонував хроматографію російський ботанік M.C. Цвєт. Історія виникнення хроматографії як науки відноситься до 1903 року, коли в працях Варшавського університету з'явилася програмна стаття російського вченого Михайла Семеновича Цвєта "Про нові категорії адсорбційних явищ і їх застосування до біохімічному аналізу". Як виявилося згодом, саме в цій роботі вперше були викладені основи хроматографічного методу.

Михайло Семенович Цвєт був ботаніком-біохіміком з широкими суто хімічними інтересами. Народився М. С. Цвєт 14 травня 1872 в невеликому італійському місті Асті. Мати його – італійка Марія Де Дороцца – прийомна дочка в сім'ї відомих російських письменників Жемчужникова (учасників групи російських письменників, що публікувалися під псевдонімом Козьма Прутков). Батько – Семен Миколайович Цвєт, уродженець м. Чернігова – видатний державний службовець. Освіту М. С. Цвєт отримав у Швейцарії. Він закінчив Женевський університет, в ньому почав свої наукові дослідження і в 24-річному віці, в 1896 році, отримав ступінь доктора ботаніки. У 1900 році М. С. Цвєт переїжджає в Росію, де починає працювати в Петербурзі в Ботанічній лабораторії Академії Наук. Тут йому доводиться знову захищати спочатку магістерську дисертацію (в Казанському університеті у 1902 році), потім, після переїзду в листопаді 1902 року до Варшави, захищати докторську дисертацію у Варшавському університеті в 1910 році. У Варшаві М. С. Цвєт працював до 1916 року: з 1902 до 1908 року у Варшавському університеті, а з 1908 року - у Варшавському політехнічному інституті. У період 1916-1918 рр. М. С. Цвєт працює спочатку в Москві, потім у Нижньому Новгороді і, нарешті, в Тарту. Помер М. С. Цвєт у Воронежі 26 червня 1919, був похований на кладовищі Олексіївського монастиря, повністю зруйнованого в роки II світової війни.

Повернімося, однак, до наукової діяльності М. С. Цвєта. Одним з основних наукових питань, яким він займався, було питання з'ясування складу хлорофілу. М. С. Цвєт розумів, що хлорофіл, забарвлює листя рослин в зелений колір, – складна речовина, багатокомпонентна суміш, що складається з цілого ряду пігментів, і поставив перед собою завдання – виділити пігменти у вигляді індивідуальних речовин. Ha колонці, заповненій CaCO₃, він розділяв пігменти рослин. Рухомою фазою служив діетиловий ефір. Саме цим методом він виявив, що в екстракті зеленого листя міститься 2 хлорофіли, 4 ксантофіли і каротин.

Досліди М. С. Цвєта полягали в наступному. Із зелених сухого листя за допомогою петролейного ефіру, чи толуолу, він екстрагував хлорофіл, і потім частина цього екстракту (пофарбованого в інтенсивно зелений колір) він вводив в верхню частину скляної трубки, щільно набитою зернами твердого адсорбенту. В якості адсорбентів М. С. Цвєт використовував мінеральні солі (всього він обстежив адсорбційні властивості 126 солей). Введена проба вбиралася зернами адсорбенту і утворювала частини трубки забарвлену в зелений колір зону. Потім М. С. Цвєт промивав колонку чистим розчинником – чистим петролейним ефіром. При цьому через деякий час спостерігалося вельми цікаве явище: по висоті трубки з'являлися окремо розташовані забарвлені зони, відстань між якими збільшувалася у міру збільшення нових об’ємів чистого розчинника. Нижче всього знаходилася зона, пофарбована в інтенсивно жовтий колір, дещо вища зона, також забарвлена ​​в жовтий колір, набагато вище – смуга, пофарбована в зелений колір і ще вище– смуга, пофарбована в жовто-зелений колір.

М. С. Цвєт припустив, що ці зони відповідають індивідуальним пігментам, розрізав скляну трубку так, щоб відокремити зону одну від іншої, виштовхував адсорбент, екстрагував пігменти і досліджував їх властивості. Він встановив, що нижче всього йде зона – каротин, речовина, яка забарвлює морквяний сік в жовтий колір, вище розташовується пігмент ксантофілл, ще вище знаходяться пігмент хлорофіл-А і пігмент хлорофіл-В.

Таким чином, М. С. Цвєту вдалося відкрити явище розділення складної за складом суміші на індивідуальні компоненти. Однак заслуга М. С. Цвєта полягає не тільки, та й не стільки в цьому відкритті, як у тому, що він правильно зрозумів фізичну суть виникаючих при цьому явищ.

М. С. Цвєт не тільки відкрив саме явище розділення, правильно зрозумів фізичний зміст процесів, що відбуваються, але навіть запропонував і термінологію, яка збереглася до теперішнього часу. В даний час заслуги М. С. Цвєта визнані у всьому світі.

Та хроматографія, яку відкрив М. С. Цвєт, класифікується за прийнятою класифікацією як адсорбційна хроматографія або молекулярна хроматографія. Однак, по суті, М. С. Цвєт є першовідкривачем всій хроматографії, оскільки те, що почало розвиватися потім, відбулося на основі саме цих робіт М. С. Цвєта.

Як розвивалися події в науковому світі після робіт М. С. Цвєта? Хроматографію спочатку використовували дуже рідко, вона з'явилася дуже рано і в той час ще не могла бути зрозуміла і прийнята по достоїнству. З історії розвитку науки добре відомо, що значення видатних відкриттів далеко не завжди усвідомлюється відразу. У багатьох випадках подальший розвиток починається лише після значного проміжку часу. Протяжність такого прихованого періоду є як би мірою того, наскільки людина, яка зробила відкриття, випередив своїх сучасників.

Прихований період розвитку хроматографії закінчився в 1931 році, після того, як Е. Ледерер, прочитавши зроблений Г. Вільштетером рукописний переклад книги М. С. Цвєта на німецьку мову, провів хроматографічне розділення каротинів. З цього часу хроматографія і стала широко використовуватися в ботанічних і біохімічних лабораторіях:

1. У 1938 році в Харківському хіміко-фармацевтичному інституті Н. А. Ізмайлов і М. С. Шрайбер розробили основи методу хроматографії в тонких шарах.

2. У 1940 році А. Мартін і Д. Сінг відкрили варіант рідинної розподільної хроматографії на прикладі розділення ацетильних похідних амінокислот на колонці, заповненій силікагелем, насиченим водою, з використанням хлороформу в якості рухомого розчинника. Тоді ж було відзначено, що в якості рухомої фази може бути використана не тільки рідину, але і газ. Було встановлено, що в основі розділення речовин методом розподільної хроматографії лежить закон розподілу, а не адсорбційні явища, як у разі хроматографії Цвєта. Дійсно, якщо маємо дві рідкі фази, які не змішуються одна з другою (наприклад, вода-толуол, вода-бензол), і в одну з фаз ввести досліджувану сполуку і ретельно перемішати фази, то через деякий час встановлюється рівновага розподілу досліджуваної сполуки між фазами, яке описується законом розподілу. Тепер, якщо одну з фаз цієї системи зробити нерухомою (наприклад, закріпити на твердому носії), заповнити цією фазою колонку і пропускати через колонку іншу, яка не змішується з першою фазою, то при введенні в колонку суміші речовин вони будуть розподілятися між фазами відповідно до величинами коефіцієнтів розподілу досліджуваних сполук в даній системі фаз. Тоді при багаторазовому повторенні по висоті колонки процесу переходу досліджуваних сполук з однієї фази в іншу, ті речовини, які краще розчиняються в рухомий фазі, будуть переміщатися по колонці з більшою швидкістю, ніж речовини, краще розчиняються в нерухомій фазі, в результаті чого і здійснюється процес поділу. За відкриття розподільчого варіанту хроматографії А.Мартін і Джеймс у 1952 році отримали Нобелівську премію.

3. У цей же період часу були синтезовані синтетичні іонообмінні смоли, з використанням яких виконані дослідження, що стали основою іонообмінної хроматографії.

4. Революційне значення для появи аналітичної хроматографії мало відкриття методу газо-рідинної хроматографії у 1952-1953 роках А. Мартіном і Д. Сінгом та істотна модернізація методу газо-адсорбційної хроматографії Янакі в 1953 р.

5. Виключне значення для розвитку хроматографії мало створення в 1956 році М. Голеєм варіанта високоефективної капілярної газової хроматографії.

6. У 1962 році М. Порат і Д. Флодін створили варіант ситової хроматографії і застосували його для розділення високомолекулярних сполук.

7. З середини 70-х років починається період інтенсивного розвитку високоефективної рідинної хроматографії, яка розширила коло аналізованих органічних сполук на полярні та інші нелеткі речовини.

8. З відкриттям у 1975 р. методу іонної хроматографії з'явилася можливість експресного і високоінформативного аналізу іонних сумішей.

9. З середини 80-х років отримали розвиток практичне використання флюїдной хроматографії і повна комп'ютеризація всього хроматографічного процесу.

Подальший розвиток аналітичної хроматографії йде в напрямках модернізації апаратури (сорбенти, режими, детектори), математичного моделювання процесів поділу, розвитку способів отримання якісної та кількісної інформації з даних хроматографічного експерименту і пошуку нових областей застосування хроматографії.