Основы метода спектрофотометрии биотканей

В задачах оптической диагностики и спектрофотометрии биотканей различают два режима облучения: непрерывный и с разрешением во времени (рис. 1). Режим с разрешением во времени может быть реализован как путем облучения исследуемого объекта короткими лазерными импульсами (длительностью τ ~ 10^-9…10^-11 с) и приема уширенных импульсов рассеянного излучения (временной подход), так и путем облучения модулированным по интенсивности светом на частотах в диапазоне от 30 МГц до 1 ГГц и регистрации глубины модуляции интенсивности рассеянного излучения и соответствующего сдвига фазы на частотах модуляции (частотный или фазово-модуляционный) подход [1-3,8-10].

 

 

Рис. 1. Схематичное изображение трех вариантов зондирования

в спектрофотометрии биотканей; I, ф, М – интенсивность/средний

уровень интенсивности, фазовый сдвиг и амплитуда модуляции [5]

 

Распространение немодулированного света в биотканях (непрерывный режим)

Ослабление коллимированного лазерного пучка в биоткани происходит по экспоненциальному закону, закону Бера-Ламберта-Бугера (Beer-Lambert-Bouger)

 

, (5)

 

где R_F – коэффициент френелевского отражения при нормальном падении пучка;

R_F=[(n-1)/(n+1)]²; n – относительный показатель преломления биоткани; I₀ – интенсивность падающего света; d – толщина образца.

При анализе распространения света в биотканях с многократным рассеянием предполагают обычно равномерное распределение поглощающих и рассеивающих центров. Достаточно строгое математическое описание процесса распространения немодулированного света в рассеивающей среде может быть сделано с помощью стационарной теории переноса излучения (ТПИ). ТПИ, или транспортная теория, с успехом применяется при решении ряда практических задач из оптики биотканей.

Основное ограничение спектрофотометрических методов с непрерывным режимом – невозможность разделения эффектов поглощения и рассеяния излучения в биоткани, следовательно, невозможность получения абсолютных значений показателя поглощения (m_а) и концентраций основных хромофоров, являющихся показателями метаболических процессов и микрогемоциркуляции в тканях.

Для модели полубесконечной однородной по оптическим свойствам среды и рассеянного в обратном направлении излучения при контактных измерениях применим модифицированный закон Бера-Ламберта-Бугера, который выражается следующей формулой:

 

I=I₀·exp{-(m_a·r·DPF+G)} (6)

 

где I – средний уровень интенсивности прошедшего биоткань излучения, I₀ – средний уровень интенсивности зондирующего излучения, μ_a – коэффициент поглощения исследуемой биоткани, среды или фантома, r – расстояние между источником и приемником – между точкой входа излучения в биоткань, либо фантом, и точкой выхода обратно рассеянного излучения из биоткани, DPF – безразмерный дифференциальный фактор длины пути, учитывающий многократное рассеяние излучения в среде, G – ослабление излучения в среде, помимо влияния поглотителей [1, стр.453]. Величина DPF для многокартно рассеивающих биологических тканей находится в диапазоне 5,6 – 6,0; экспериментальные исследования по определению DPF проводились A. Duncan с соавторами [7].

Из уравнения (6) следует, что величина ослабления (A) излучения длиной волны λ_j в среде определяется значениями параметров μ_a, r и DPF на этой длине волны (7). Коэффициент поглощения (μ_a) среды на длине волны λ_j зависит от молярных коэффициентов экстинкции ε_i и концентраций C_i всех N поглотителей в среде (7).

 

A(λ_j)=ln(I₀(λ_j)/I(λ_j))=m_a(λ_j)·r·DPF(λ_j)+G(λ_j),

m_a(λ_j)=S_ie_i(λ_j)·C_i, i=1..N. (7)

 

В соответствии с модифицированным законом Бера-Ламберта-Бугера, уравнениями (6) и (7), с увеличением r будет происходить эспоненциальное затухание регистрируемой интенсивности I. Величины затухания излучения и коэффициента поглощения среды прямо пропорциональны концентрациям поглотителей. Исследование фантомов биотканей с известными оптическими свойствами позволяет оценивать величину DPF [1,7,8], значения молярных коэффициентов экстинкции поглотителей, хромофоров. Величина DPF для сильно рассеивающих биологических тканей определяет 5-7-кратное увеличение траектории движения фотонов красного и ближнего инфракрасного спектральных диапазонов в среде. Твердые фантомы биотканей на основе водных гелей (с 10% объемной долей интралипида в качестве рассеивателя и с добавлением чернил для определенного поглощения, [1, стр. 288]) характеризуются значением DPF близким к 6.

Методы с непрерывным режимом облучения применимы для определения относительных значений концентраций поглощающих веществ в биологических тканях.

 

Распространение модулированного излучения в биотканях (фазово-модуляционный подход)

Фундаментальной основой режимов с временным разрешением (временной подход и частотный подход) является нестационарная теория переноса излучения [1].

В тканевых оксиметрах абсолютных значений чаще реализуют частотный, или фазово-модуляционный, подход с многодистантными измерениями. Развитие теории данного метода привело к открытию сильно затухающих волн интенсивности, так называемых волн фотонной плотности на частоте модуляции интенсивности (f=ω/2p=0,3–1000 МГц, рис. 2), распространяющихся от источника излучения в среде и обладающих волновыми свойствами. По регистрируемым значениям переменной (AC) и средней (DC) составляющих интенсивности излучения, рассеянного в обратном направлении, и сдвигу фазы (φ) относительно фазы опорного, зондирующего излучения вычисляют оптические параметры исследуемой ткани: коэффициент поглощения (μ_a) и транспортный коэффициент рассеяния (μ_s’). Соответствующие аналитические зависимости были получены в рамках диффузионного приближения при решении нестационарного интегро-дифференциального уравнения переноса излучения с рядом допущений, в том числе в отношении структурных и оптических свойств исследуемой среды [1,8,9].

Многодистантный метод измерений при частотном подходе позволяет определять наклоны характеристик, зависящих от AC и φ, при разных расстояниях (r) между источниками и приемником, что обеспечивает определение абсолютных значений оптических коэффициентов, μ_а и μ_s' [1,3,8,9]. Многодистантный частотный подход хорошо работает при полубесконечной геометрии оптически однородной среды. Оптические коэффициенты многократно рассеивающей среды восстанавливаются при варьировании не только величины r, но также при изменении частоты модуляции (f) и длины волны (λ) зондирующего излучения, а также при изменении этих параметров одновременно.

 

 

Рис. 2. Изменение параметров излучения, прошедшего

биоткань, при частотном подходе [11]

 

Рисунок 3. Принцип измерения оптических параметров биоткани при частотном многодистанционном подходе

 

Установлено, что при многодистантном частотном подходе каждый из параметров: ln[rAC], ln[rDC] и (или ΔΦ), - является линейной функцией r – расстояния от источника до приемника (рис. 3); наклоны этих зависимостей (М_AC, М_DC и М_PH) являются функциями оптических коэффициентов m_а и m_s' среды; пересечения этих линий (B_AC, B_DC и ) зависят от параметров источника излучения [1,3,8,9].

Таким образом, все, что необходимо сделать, это измерить наклоны характеристик ln[rAC], ln[rDC] и ΔΦ, как функций от r, где r = r – растояние между источником и приемником. Поскольку мы имеем два неизвестных и три уравнения, в действительности необходимо регистрировать только два из трех параметров. Обычно используют AC и ΔΦ, т.к. AC и ΔΦ менее чувствительны к окружающей засветке, чем интенсивность DC. Используя два выбранных наклона М_AC и М_PH, можно записать выражения для m_а и m_s':

; , (8)

где с = (3 ´ 10¹⁰/1,33) см/с - скорость света в среде, 2pf=w - круговая частота модуляции интенсивности зондирующего излучения.

Оптические коэффициенты многократно рассеивающей среды востанавливают при варьировании не только величиной r, но также при изменении частоты модуляци и при изменении обоих этих параметров одновременно [1].

Важной особенностью уравнений (8) является то, что из относительных измерений получают абсолютные значения оптических параметров среды - биоткани. Любой метод, преследующий получение абсолютных значений оптических коэффициентов и основанный на абсолютных значениях интенсивностей, обречён на провал, т.к. существует множество причин, влияющих на значение интенсивности, и не возможно все их предусмотреть и учесть в проводимых измерениях и вычислениях.

Многодистантный метод позволяет иметь дело только с наклонами, что в свою очередь обеспечивает определение абсолютных значений оптических коэффициентов. Однако данный метод пригоден и для более сложных геометрий среды, чем бесконечная однородная среда. Fantini S. с соавторами продемонстрировали, что многодистанционный подход хорошо работает и при полубесконечной геометрии [9]. Уравнения несколько более сложные, чем уравнения для бесконечной среды, отражают зависимость оптических коэффициентов от наклонов выражений, содержащих измеряемые параметры AC, DC и ΔΦ. Оптические параметры для полубесконечной однородной среды вычисляются на основании выражений (8), где используются наклоны зависимостей ln[r²AC], ln[r²DC] и ΔΦ от расстояния между источником и приемником r.

Сегодня активно ведутся исследования по повышению точности in vivo измерений оптических параметров биологических тканей, имеющих сложную неоднородную слоистую структуру, и вычислению параметров оксигенации ткани и параметров локального кровообращения [1,2]. Для этих целей проводят физические эксперименты – измерения на фантомах с известными оптическими свойствами и структурой и биообъектах, а также вычислительные эксперименты – статистическое моделирование методом Монте Карло [1].

 

Одним из ограничений большинства современных тканевых оксиметров, спектрофотометров, является невозможность определения абсолютных значений концентраций хромофоров в биотканях in vivo. На российском рынке тканевые оксиметры, разрешенные для клинического использования, представлены, в основном, американскими фирмами CasMed ("Fore-sight") и Somanetics ("Invos"), а также японскими оксиметрами марки “NIRO” компании Hamamatsu. В указанных оксиметрах используется метод непрерывного излучения, который позволяет оценивать только относительные изменения параметров оксигенации ткани.

Отечественные аналоги «ЛАКК-М» (ООО НПП «ЛАЗМА»), «Спектротест» (ФГУП НПП «Циклон-тест») и «Лаздиком» (ЗАО Исток-ЭОС) предназначены для контроля параметров микроциркуляции крови в поверхностных слоях, в коже. Конструкция датчиков, принцип действия, отсутствие абсолютных значений параметров и малая глубина зондирования не позволяют использовать их в качестве церебральных оксиметров.

Абсолютные значения оптических параметров, концентраций хромофоров и расчетных параметров дают оксиметры с временным разрешением, использующие зондирование тканей пикосекундными импульсами - временной подход, либо радиочастотную модуляцию интенсивности излучения - частотный или фазово-модуляционный подход (рис. 1). К таким оксиметрам относятся «TRS20» (Hamamatsu, Япония) реализующий временной подход, и «OxiplexTS» (ISS, Inc., США) - с частотным подходом [10].

Принцип действия, функциональные возможности, ограничения и достоинства тканевых оксиметров различных производителей рассмотрены в обзоре M. Wolf с соавторами [2].