ПРАВИЛА ОФОРМЛЕНИЯ ОТЧЕТА.

1. Ответить письменно на контрольные вопросы.

2. Составить акт отбора проб растительного лекарственного сырья и жидкой лекарственной формы для санитарно-микробиологического исследования.

3. Записать схему посева отобранных проб на питательные среды с целью определения общего микробного числа, сальмонелл, синегнойной палочки, стафилококка, бактерий кишечной группы.

4. Определить микробное число жидкой лекарственной формы по демонстрационному посеву; сделать вывод о соответствии требованиям к микробиологической чистоте готовых лекарственных форм.

5. Определить наличие/отсутствие в жидкой лекарственной форме стафилококков, бактерий группы кишечной палочки, сальмонелл, синегнойной палочки; сделать вывод о соответствии требованиям к микробиологической чистоте готовых лекарственных форм.

Дополнительный материал в помощь студенту.

В зависимости от локализации микрофлору растений делят на микроф­лору надземной части и микрофлору корней и корневищ. Микроорганизмы, постоянно обитающие на надземных частях растений, относят к эпифитным. В норме эпифитная микрофлора встречается на стебле, листьях, цветках, семенах. Эти микроорганизмы не способны проникать в ткани растений, питаются их выделениями и органическими загрязнениями на поверхности растений. Они устойчивы к высушиванию, действию ультрафиолетовых лучей, фитонцидам. Состав эпифитной микрофлоры зависит от вида, возраста растений, типа почвы и температуры окружающей среды. Наибольшее количество эпи­фитной микрофлоры (до 90%) составляют грамотрицательные бактерии ро­да Erwinia (E. herbicola) и рода Pseudomonas (P.fluorescens). В не­большом количестве встречаются споровые бактерии (Bacillus mesenteri­cus), молочнокислые бактерии рода Lactobacillus, дрожжи, актиномицеты.

Микрофлора корней и корневищ в основном сосредоточена в ризосфере – зоне почвы, прилегающей к корням растений. Микроорганизмы ризосферы обеспечивают минерализацию органических веществ, трансформируя их в простые соединения, приемлемые для питания растений. Кроме того, они синтезируют би­ологически активные соединения (витамины, аминокислоты, ферменты), стимулирующие корневое питание и, в целом, обмен веществ в клетках растений. Среди микроор­ганизмов ризосферы наиболее часто встречаются грибы, актиномицеты и бактерии родов Pseudomonas, Mycobacterium, Bacillus. Некоторые микро­организмы находятся в особых мутуалистических отношениях с растениями. Так, симбиоз между грибами и растениями называют микоризой. Микориза – это морфологически единое образование, состоящее из мицелия гриба и корневой системы растения. Нити мицелия грибов образуют своеобразный чехол вокруг корня растения. Микориза обеспечивает растение аминокис­лотами, минеральными веществами, водой, неорганическими соединениями азота и серы, расщепляет вещества, угнетающие развитие растений. Мико­ризы обнаруживаются в различных почвах (кроме известковых). Различают несколько вариантов микоризы: а) эктотрофную (гриб оплетает кончики корней растений наподо­бие чехла, а отдельные гифы заходят между клетками эпидермиса); б) эн­дотрофную (гифы гриба проникают внутрь клеток первичной коры корня, где образуют сплетения в виде клубков); в) сочетание эктотроф­ной и эндотрофной микоризы. Основных представителей микоризных грибов относят к классам Basidiomycetes, Phycomycetes, Deuteromycetes.

От микориз следует отличать псевдомикоризы, образуемые фитопато­генными грибами. Псевдомикоризы представлены простым сплетением нитей грибов с корнями растений. В отличии от истиннной микоризы грибница псевдомикоризы легко отделяется от корня.

МЕХАНИЗМЫ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ.

1. Анатомо-морфологические особенности растений. К ним относят анатомическое строение листьев, величину устьиц, восковидный налет или густой слой волосков на поверхности листьев, который затрудняет смачивание листьев при попадании капель воды, в которых могут находиться споры фитопатогенных микробов, поэтому капли воды не задерживаются на листе, а скатываются.

2. Реакция клеточного сока.

3. Химические вещества, содержащиеся в неповрежденных здоровых растениях:

- углеводы (фруктозы, галактоза, арабиноза) обладают противогрибковой активностью

- аминокислоты. Например, аргинин оказывает фунгицидное действие на конидии фитофторы; фенилаланин – на споры парши, лицин подавляет рост и размножение грибов, вызывающих ржавчину

- летучие и нелетучие вещества (фитонциды) обладают выраженным бактериоцидным и фунгицидным действием. Относятся к различным химическим группам: алкалоидам, дубильным веществам, альдегидам, глюкозидам, основным механизмом действия которых является угнетение жизненно важных ферментов бактерий. Например, в летучих фракциях фитонцидов черемухи установлено содержание синильной кислоты. В летучих фракциях фитонцидов листьев черники, черной смородины, ясеня установлено присутствие гексанана, листьях бессмертника обнаружены смоляные кислоты.

- фенолы. В здоровых растениях содержатся в небольших концентрациях, при повреждении тканей и клеток фенолы претерпевают химическое изменение, их активность и концентрация увеличиваются.

4. Химические вещества, которые синтезируются в растениях только при поражении их фитопатогенными микроорганизмами:

- интерфероны. Обладают противовирусной активностью.

- фитоалексины (антибиотикоподобные вещества). Один вид растений может синтезировать несколько фитоалексинов. Например, у растений семейства пасленовых при инфицировании фитопатогенными микроорганизмами образуются фитоалексины из класса терпеноидов: ришитин и любелин. Фитоалексины повреждают клеточные мембраны, подавляют синтез нуклеиновых кислот и белков у микроорганизмов.

5. Защитное действие эпифитной микрофлора и микрофлоры микоризы. В основе действия этого механизма лежат конкурентные взаимоотношения эпифитной и фитопатогенной микрофлоры.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ

Род Pseudomonas. Фитопатогенные виды (P. syringae, P. cichorii, P. solanacearum и др.), входящие в этот род составляют наиболее многочисленную группу возбудителей бактериозов. Псевдомонады - это грам-, аспорогенные палочки, подвижность обусловлена полярно расположенными жгутиками (от 1 до 7). По типу дыхания – строгие аэробы. Культивируются на простых питательных средах. На пластинчатых агаровых средах образуют округлые, с приподнятым краем прозрачные колонии, голубые в проходящем свете. Многие штаммы фитопатогенных псевдомонад образуют водорастворимый флюоресцирующий пигмент, окрашивающий колонии в желтовато-зеленый цвет, дающий в УФ лучах зеленоватую флюоресценцию. Фитопатогенные псевдомонады характеризуются слабой ферментативной активностью: большинство видов не способны ферментировать дисахара, моносахара расщепляют только до кислоты, некоторые виды обладают протеолитической активностью. Основным отличие сапрофитных псевдомонад от представителей фитопатогенных является отсутствие у последних ферментов оксидазы и аргинигидролазы. Фитопатогенные псевдомонады вызывают некрозы растительных тканей, ожоги, мягкие гнили; некоторые виды, например, P. solanacearum являются возбудителем увядания пасленовых растений.

Род Corynebacterium. Фитопатогенные виды (C. sepedonicum, С. insidiosum, C. michiganense, C. betae и др.) – это грам+, аспорогенные палочки, иногда неправильной формы, некоторые виды имеет тенденцию к ветвлению, в цитоплазме содержат гранулы. У фитопатогенных коринебактерий полиморфизм менее выражен, чем у видов патогенных для человека и животных. Некоторые виды коринебактерий подвижны. По типу дыхания факультативные анаэробы. Культивируются на специальных питательных средах, рост медленный, колонии вырастают через 3-4 суток. Природным резервуаром фитопатогенных коринебактерий является почва: жизнеспособность в течение длительного времени сохраняют только в симбиозе с корневой системой живых растений или отмершими растительными тканями. Являются возбудителями гуммоза соцветий, пятнистости листьев, гипертрофии стеблей.

Род Xanthomonas. Род включает только фитопатогенные виды – X. campestris, X.. axonopodis и др.. Представители этого рода – грам-, аспорогенные, аэробные, прямые палочки, монотрихи. Бактерии синтезируют нерастворимые в воде каратиноидные пигменты. Питательные потребности сложные, культивируются на средах с содержанием метионина, глютаминовой кислоты, никотиновой кислоты в различных соотношениях. Оптимальная температура культивирования +25-27⁰С. На агаровых пластинчатых средах образуют крупные слизистые колонии желтого цвета. Обладают протеолитической активностью, большинство видов гидролизуют крахмал, некоторые виды расщепляют моно- и дисахариды только с образованием кислоты. Отличительным признаком представителей этого рода является отсутствие способности утилизировать салицин. Для бактерий рода Xanthomonas характерна видовая специфичность в отношении растений-хозяев, которая используется для видовой идентификации. Бактерии рода Xanthomonas являются паразитами надземных зеленых частей растений, вызывают некрозы тканей типа пятнистостей. Сохраняют жизнеспособность в течение длительного времени при низкой (-21–22⁰С) и комнатной температуре, но только в сухих тканях и быстро погибают при этих значениях температур во влажной среде. Природным резервуаром представителей рода Xanthomonas являются семена и надземные зеленые части растений.

Род Rhizobium. Род Agrobacterium. Ризобиумы и агробактерии – грам-, аспорогенные, подвижные палочки, движутся при помощи 2 – 6 перитрихиальных жгутиков или одного полярного или субполярного. По типу дыхания аэробы, температурный оптимум +25-30⁰C. Питательные потребности у разных штаммов отличаются: некоторые культивируются на простых питательных средах, содержащих дрожжевой экстракт и минеральные соли, другие для культивирования нуждаются в водорастворимых витаминах, на средах с углеводами образуют крупные слизистые колонии, за счет синтеза внеклеточной слизи. Протеолитической активностью не обладают, расщепляют различные углеводы без газообразования. Представители рода Rhizobium. способны инфицировать корневые волоски бобовых растений с образованием корневых клубеньков, в которых бактерии живут как внутриклеточные симбионты, фиксируя молекулярный азот и трансформируя его в соединения, пригодные для использования растением-хозяином. Для штаммов Rhizobium. характерна специфичность в отношении растений – хозяев. Способность инфицировать корневые волоски и связывать атмосферный азот не связаны друг с другом, варьируют в широких пределах и зависят от генома бактериального штамма и растения-хозяина. В клубеньках, вследствие частичного подавления синтеза белка, ризобиумы имеют плеоморфную морфологию (глобулярную, эллипсоидную или разветвленную). Фитопатогенные виды (A. tumefaciens, A. radiobacter и др.) вызывают опухолевидные образования на многих видах лекарственных растений, в том числе A. tumefaciens является возбудителем корневого рака растений. Инфицирование тканей растения агробактериями происходит только через существующие повреждения, На вирулентные свойства бактерий этого рода оказывают влияние бактериофаги, концентрация некоторых органических веществ и водородных ионов в окружающей среде. Так, например, на кислых почвах бактериальный корневой рак развивается в меньшей степени, чем на щелочных почвах.

Род Erwinia. Представители этого рода грам-, подвижные, аспорогенные палочки. По типу дыхания факультативные анаэробы. Оптимальная температура для культивирования +27-30⁰С. Растут на простых питательных средах. При оптимальных условиях культивирования на пластинчатых агаровых средах образуют колонии беловато-серого или беловато-желтого цвета. Оксидазоотрицательны, каталазоположительны, не гидролизуют крахмал. Природным резервуаром ервиний, в основном, являются растения, для некоторых штаммов – почва и насекомые. Фитопатогенные виды Erwinia вызывают поражения лекарственных растений типа ожога и увядания.