Дослід 1. Визначення ДНК за фосфором. - раздел Философия, З БІОЛОГІЧНОЇ ХІМІЇ Принцип Методу.Метод Грунтується На Отриманні Вільних Нуклеї...
Принцип методу.Метод грунтується на отриманні вільних нуклеїнових кислот із наступним визначенням кількості ДНК за фосфором, що утворюється у формі фосфату після мінералізації (спалювання) ДНК. Визначення фосфору проводять фотоколориметрично за реакцією з амонію молібдатом за присутності відновника (аскорбінова кислота). Інтенсивність забарвлення продукту реакції – молібденової сині – є пропорційною кількості фосфору у пробі.
Матеріальне забезпечення:Тканина печінки щурів, 1 н розчин натрію гідроксиду (NaOH), 30 % розчин натрію гідроксиду (NaOH), насичений розчин натрію хлориду (NaCl), 20 % розчин ацетатної кислоти (CH3COOH), етиловий спирт, 5 % розчин ТХАК, концентрована сульфатна кислота (H2SO4), 30 % розчин гідрогену пероксиду (Н2О2), стандартний розчин калію дигідрогенфосфату (КН2РО4) 0,01 мг/мл, 2,5 % розчин амонію молібдату ((NH4)2MoO4), 1 % розчин аскорбінової кислоти, центрифуга, ФЕК, пробірки центрифугові, скляні палички, колба К’єльдаля, конічна колба, льодяна баня, пісчана баня.
Хід роботи:
1. Оброблення тканин основою. Наважку тканини печінки масою 100 мг нагрівають з 1 мл 1 н розчину натрію гідроксиду у центрифужній пробірці протягом 15 хв на киплячій водяній бані. Періодично вміст пробірки перемішують скляною паличкою.
2. Послідовне осадження білків і ДНК. Пробу поступово охолоджують за кімнатної температури, а потім за температури 0°С (лід). До охолодженого гідролізату додають 0,5 мл насиченого розчину натрію хлориду у 20 % розчині ацетатної кислоти для осадження білків. Осаджений білок видаляють через 5 хв шляхом центрифугування протягом 5 хв за швидкості 5000 об/хв. Центрифугат зливають у центрифужну пробірку (під час охолодження на льоду), додають до нього 6 мл етилового спирту і витримують протягом 1 год на холоді для повного осадження ДНК. Ще раз центрифугують протягом 5 хв за швидкості 5000 об./хв. Осад ДНК відмивають 5 мл 5% розчину ТХАК.
3. Отримання мінералізату. Осад ДНК кількісно переносять у колбу К’єльдаля, додають 1,5 мл сульфатної концентрованої кислоти і нагрівають (мінералізують) на пісчаній бані до повного освітлення розчину. Для прискорення мінералізації до розчину обережно додають декілька крапель 30 % розчину гідрогену пероксиду (по одній краплі). Після закінчення мінералізації рідину з колби К’єльдаля кількісно (вимірюючи об’єм) переносять у колбу Ерленмеєра. Розчин нейтралізують 30 % розчином натрію гідроксиду за допомогою універсального індикатора. Отриманий мінералізат переносять кількісно у мірну колбу на 50 мл і доводять до позначки дистильованою водою.
4. Визначення ДНК за фосфором. З колби у пробірку відбирають 5 мл розчину, додають 0,5 мл 2,5 % розчину амонію молібдату, 0,5 мл 1 % розчину аскорбінової кислоти і 4 мл дистильованої води. Через 10 хв вимірюють оптичну густину розчину (А) проти води за червоного світлофільтра (довжина хвилі 670 нм) у кюветах завтовшки 5 мм. Вміст фосфору (С) визначають у мкг/мл за калібрувальною кривою.
Для побудови калібрувального графіка використовують стандартні розчини калію дигідрогенфосфату, які містять відповідно 1, 2, 3, 4 мкг фосфору в 1 мл проби. На осі абсцис відкладають значення концентрацій стандартних розчинів фосфору, а на осі ординат – відповідні їм значення оптичної густини.
Графік залежності оптичної густини від концентрації фосфору
Концентрацію ДНК визначають у мг% за формулою:
Х = 10 х С, де
Х – вміст ДНК ( мг%),
С – концентрація фосфору (мкг/мл),
10– коефіцієнт перерахунку.
Нормальний вміст ДНК у печінці щурів становить 25–35 мг% (мг на 100 г тканини).
Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.
Клініко–діагностичне значення.Визначеннякількості ДНК у тканинах пухлини використовують для оцінки прогнозу онкологічних захворювань та можливої індивідуалізації наступного лікування. Крім того, виділюють ДНК з клінічних зразків ( біоптати тканин, крапля крові, сперма, слиз жіночих статевих органів, осад сечі, волосся людини, зішкреби епітеліальних клітин тощо) для ланцюгової полімеразної реакції в діагностиці вірусних та спадкових хвороб людини, ідентифікації особини ("ДНК–діагностика") тощо.
При доклінічному експериментальному дослідженні новостворених фармпрепаратів вивчають їх безпосередній вплив як на клітинні органели (ядро, мітохондрії тощо), так і їх компоненти. Тому, в разі отримання субклітинних фракцій клітин, необхідний суворий контроль за їх чистотою і гомогенністю. Однією з головних причин забруднення цитоплазматичних фракцій ядерним матеріалом (а саме, ДНК) є неякісна гомогенізація, що призводить до руйнування ядер. Для оцінки чистоти отриманих цитоплазматичних фракцій у них кількісно визначають ДНК.
Все темы данного раздела:
Методика проведення та критерії оцінювання підсумкового модульного контролю
Підсумковий модульний контроль складається з 3 етапів:
І етап - письмова відповідь на тестові завдання формату А (бланковий або комп'ютерний тестовий контроль). Студент відповідає на пакет
Теоретичні питання
1. Структура та номенклатура азотистих основ, нуклеозитів і нуклеотидів. Мінорні азотисті основи та нуклеотиди.
2. Вільні біологічно активні нуклеотиди та їх біохімічні функції: участь у м
Дослід 4. Молібденова проба на фосфатну кислоту.
Принцип методу.Фосфати у кислому середовищі утворюють з молібдатами забарвлені фосфатно-молібденові комплекси.
Матеріальне забезпечення: гідролізат дріждж
Дослід 1. Кількісне визначення сечової кислоти в сироватці крові.
Принцип методу.Сечова кислота відновлює фосфатвольфраматний реактив з утворенням сполуки блакитного кольору, оптична густина якої за довжини хвилі 640 нм є пропорційною концентраці
Дослід 2. Кількісне визначення сечової кислоти в сечі.
Принцип методу.Метод грунтується на здатності сечової кислоти відновлювати фосфатвольфраматний реактив до фосфатвольфраматного синього, інтенсивність забарвлення якого пропорційна
Дослід 2. Аналіз екстрактів антибіотиків методом тонкошарової рідинної хроматографії (ТШХ).
Принцип методу ТШХ базується на різниці в швидкості рухливості хімічних сполук у суміші, що є нанесеними на сорбент при їхньому переміщені в потоці рухомої фази (суміш розчинників)
Е. Фосфатні залишки
6. Похідне уридину – фторурацил, який перетворюється в клітині в фтордезоксиуридилат – сильний незворотній інгібітор тимідилатсинтази. Як пояснити факт пригнічення фторурацилом
Дослід № 1. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР).
ПЛР – це високоспецифічний метод експрес–діагностики, що дозволяє множити певні нуклеотидні послідовності до утворення необмеженого числа копій генів в таких кількостях, які можна виявити методом м
Приклад задачі
У хворої з попереднім діагнозом на трихомоніаз для ПЛР використали зішкреби епітеліальних клітин уретри. Після виділення ДНК та приєднання праймерів до кожного з ланцюгів ДНК недобудованими залишил
Теоретичні питання
1. Гормони та інші біорегулятори у системі міжклітинної інтеграції функцій організму людини. Визначення, властивості. Класифікація гормонів за хімічною будовою, місцем синтезу.
2. Регуляці
Дослід 3. Реакція з хлорним залізом.
Принцип методу. Адреналін легко окиснюється на повітрі з утворенням адренохрому, який дає смарагдово-зелене забарвлення із феруму хлоридом.
Матеріальне забезпеченн
Теоретичні питання
1. Механізм дії (цитозольний) тироїдних гормонів щитоподібної залози та стероїдних гормонів (цитозольні та ядерні рецептори).
2. Тиреоїдні гормони щитоподібної залози:
· структура
Дослід 1. Якісна реакція на 17-кетостероїди сечі.
17-кетостероїдами називають всі стероїди, які мають кето-групу біля 17-го вуглецевого атома, такі як андростерон. Вони утворюються із стероїдів, які мають ОН-групу в 17-му положенні (кортизол, корт
Дослід 2. Якісна реакція на йод в розчині тироксину.
Принцип методу. При руйнуванні молекули тироксину утворюється йодистий калій, з якого йод легко витісняється йодноватим калієм. Йод, який виділився, дає синє забарвлення з крохмале
D. Стимулюють фосфороліз глікогену
Е. Підвищують активність глікогенфосфорилази
3. В організмі людини деякі амінокислоти перетворються у гормони. Вкажіть, у яку гормоноподібну сполуку може перетворитися
Тема №7. Дослідження нервової тканини. Патохімія психічних порушень.
Мета заняття: Знати склад і біохімічні особливості обміну речовин у нервовій тканині, її функціонування в нормі і при деяких захворюваннях. Оволодіти методом визнач
Теоретичні питання
1. Особливості біохімічного складу та метаболізму нервової тканини
· хімічний склад головного мозку;
· нейроспецифічні білки та ліпіди ( гангліозиди, цереброзиди, холестерол );
Дослід 1. Визначення активності холінестерази в сироватці крові титраметричним методом Мішеля.
Принцип методу.Метод оснований на ферментативному гідролізі ацетилхоліну з утворенням ацетатної кислоти, яку визначають титруванням за допомогою натрію гідроксиду.
Теоретичні питання
1. Ультраструктура та біохімічний склад міоцитів; структурна організація саркомерів. Білки міофібрил: міозин, актин, тропоміозин, тропонін. Молекулярна організація товстих та тонких філаментів.
Теоретичні питання
1. Структура та номенклатура азотистих основ, нуклеозидів і нуклеотидів. Мінорні азотисті основи та нуклеотиди.
2. Вільні біологічно активні нуклеотиди та їх біохімічні функції: участь у м
D. Піримідинові нуклеозиди
Е. Фосфатні залишки
2. У сучасних біохімічних дослідженнях для діагностики спадкових захворювань, виявлення присутності в організмі певних вірусів (в тому числі ВІЛ),
Тематичний план практичних занять з модуля 5
№
з/п
Тема
Кількість годин
Дослідження процесу перетравлення поживних речовин (білків, ву
Тематичний план лекцій з модуля 5
№
з/п
Тема
Кіл-сть
год
Біохімія харчування людини. Процеси перетравлення поживних речовин (білків, вугл
Методика проведення та критерії оцінювання підсумкового модульного контролю
Підсумковий модульний контроль складається з 3 етапів:
І етап - письмова відповідь на тестові завдання формату А (бланковий або комп'ютерний тестовий контроль). Студент відповідає на пакет
Теоретичні питання
1. Потреби організму людини в поживних речовинах – вуглеводах, ліпідах, білках. Енергетична цінність основних поживних речовин. Раціональне харчування. Азотистий баланс організму. Вміст поживних ре
Розрахунок.
І позначка відповідає кількості вільної хлоридної кислоти.
ІІІ позначка відповідає загальній кислотності.
Середнє арифметичне значення між ІІ і ІІІ позначками відповідає загальній
Дослід № 4. Уреазний метод виявлення в шлунковому соку Helicobacter pylori.
Принцип методу:у гастробіоптаті виявляють ензим уреазу, яка каталізує гідроліз сечовини. Аміак, що утворюється,зміщує рН розчину в лужний бік і в присутності фенолфталеїну утворюєт
B. Реакцію Уффельмана
C. Уреазний метод
D. Реакцію з резорцином
E. Пробу Фелінга
9. У пацієнта підозрюють хронічний панкреатит, оскільки у нього спостерігають явища гіпові
Тема № 2. Дослідження функціональної ролі водорозчинних (коферментних) та жиророзчинних вітамінів у метаболізмі та реалізації клітинних функцій.
Мета заняття:Засвоїти будову, загальні принципи класифікації, функціональну роль вітамінів, вітаміноподібних сполук, антивітамінів, біологічно активних добавок. Оволодіти методами
Теоретичні питання
1. Вітаміни як незамінні біологічно-активні компоненти харчування, що необхідні для організму людини. Історія відкриття вітамінів. Розвиток вітамінології в Україні.
2. Екзо- і ендогенні гі
Дослід 2. Реакція з феруму хлоридом на виявлення вітаміну Е.
Принцип методу.Спиртовий розчин a-токоферолу окиснюється феруму хлоридом до токоферилхінону червоного кольору.
Матеріальне забезпечення:токоферол (0,1 % с
E. Гепарин
Приклади тестів “Крок-1”
1. У хворого дистрофія скелетної мускулатури. При якому гіповітамінозі це спостерігається ?
A. Вітамін Е
B. Вітамін В
Тема № 3. Дослідження кислотно-основного стану крові та дихальної функції еритроцитів. Патологічні форми гемоглобінів.
Мета заняття: Вміти аналізувати біохімічний склад крові та пояснювати діагностичну роль білків плазми крові, оцінити зміни показників кінцевих продуктів метаболізму в крові. Вміти
Теоретичні питання
1. Кров – внутрішнє середовище організму. Склад крові, плазми, сироватки крові. Формені елементи крові: еритроцити, лейкоцити, тромбоцити. Об’єм крові, рН крові.
2. Гомеостатичні, фізико-х
Дослід 1. Виявлення оксигемоглобіну (НbО2)Fе2+.
Принцип методу. У разі отримання похідних гемоглобіну (окси-, карбокси-, метгемоглобіну) використовують їх властивості, зокрема те, що оксигемоглобін – нестійка сполука, карбоксиге
Теоретичні питання
1. Основні групи білків плазми крові, їх склад та вміст в нормі і при патології. Фактори, що впливають на вміст білків у плазмі крові: гіпер- , гіпо- , диспротеїнемії. Парапротеїнемії. Навести прик
Практична робота
Дослід 1. Фракціонування білків плазми крові методом висолювання: визначення альбумінів і глобулінів плазми крові.
Принцип методу.Білки можна в
Дослід 2. Визначення залишкового азоту крові (метод Боданського).
Принцип методу.Залишковий азот крові визначають у безбілковому фільтраті після осадження білків крові; безбілковий фільтрат мінералізують концентрованою сульфатною кислотою. При ць
Дослід 3. Визначення рівня середніх молекул (СМ).
Рівень середніх молекул у сироватці крові визначають методами гель-хроматографії на сефадексі, високовольтного електрофорезу, іонообмінної хроматографії і спектрофотометрії.
Спектрофотомет
Як за вмістом залишкового азоту крові та загального азоту сечі диференціювати ретенційну і продукційну азотемії?
Приклади тестів „Крок-1”
1. У пацієнта вміст загального білка в плазмі крові в межах норми. Які серед наведених показників вірогідні для цього випадку?
Теоретичні питання
1. Загальна характеристика системи гемостазу в організмі людини: судинно-тромбоцитарний і коагуляційний гемостаз.
2. Згортальна система крові; характеристика компонентів (факторів) згортан
Дослід 1. Реакція з цистеїном на вікасол.
Принцип методу.Розчин вікасолу в лужному середовищі за присутності цистеїну забарвлюється в лимонно-жовтий колір.
Матеріальне забезпечення:0,05 % розчин в
Дослід № 2. Визначення циркулюючих імунних комплексів (ЦІК).
Принцип методу. метод ґрунтується на преципітації великоглобулярних імунних комплексів, які циркулюють у крові, високомолекулярним поліетиленгліколем (ПЕГ) з подальшим обліком резу
Теоретичні питання
1. Гомеостатична роль печінки в обміні речовин цілісного організму. Біохімічні функції гепатоцитів. Роль печінки в обміні вуглеводів, ліпідів, білків, синтезі сечовини, обміні пігментів, синтезі жо
Тема № 7. Дослідження процесів біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних токсинів. Мікросомальне окиснення, цитохром Р-450.
Мета заняття: Вміти трактувати біохімічні механізми функціонування детоксикаційної системи печінки: реакції мікросомального окиснення та кон’югації в біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних то
Методи якісного визначення фенацетину та його метаболітів
Фенацетин (ацетофенітидин, ацетилфенітидин, фенідин) – 1-етокси-4-ацетамінобензол – має жаропонижуючу, протизапальну і болевгамовуючу дію. Він застосовується при головних болях, невралгії. Входить
Дослід 3. Виявлення саліцилової кислоти в крові та сечі за реакцією із феруму нітратом (III).
При
Теоретичні питання
1. Біологічна роль води та її розподілення в організмі людини. Ендогенна вода. Водний баланс, його види.
2. Регуляція водно-сольового обміну, його порушення. Дегідратація і гіпергідратація
Практична робота
Дослід 1. Колориметричний мікрометод визначення калію в сироватці крові (метод Лазарева Н.)
Принцип методу.Іони калію в присутності іонівPb2+,
Тема № 9. Сечоутворювальна функція нирок. Нормальні та патологічні компоненти сечі.
Мета заняття: Знати фізико–хімічні властивості сечі; основні біохімічні показники нормальних і патологічних компонентів та шляхи їх проникнення в сечу. Вміти провес
Дослід 1. Фізико-хімічні властивості сечі.
Матеріальне забезпечення:сеча, мірний циліндр, колбочки, набір урометрів, індикаторний папір „Ріфан”, піпетки, пробірки.
Визначення кількості сечі. Виділення сечі за певни
Хімічне дослідження на розрізнення організованих осадів від неорганізованих.
Всі елементи сечових осадів поділяють на дві великі групи: організовані і неорганізовані елементи осаду. Неорганізований осад складається з солей та кристалічних утворень, щ
Реакція сечі. Визначення рН сечі за допомогою індикаторного паперу.
На середину індикаторного папірця “Ріфан” наносять 1 – 2 краплі свіжої сечі і за зміною забарвлення одної із забарвлених смужок, яка співпадає з кольором контрольної смуги, визначають рН сечі.
Кількісне визначення вмісту білка у сечі за методом Робертса-Стольнікова-Брандберга.
Принцип методу.Метод базується на реакції осадження білків концентрованою нітратною кислотою (осад не розчиняється в надлишку кислоти), яка дає позитивний результат при наявності у
Е. Аміноацидурію
3. Для діагностики захворювання мутну сечу, що має лужну реакцію, підкислили і підігріли. При цьому осад зник. Чим зумовлена каламуть сечі?
А. Слизом із сечовидільних
Дослід 1. Кількісне визначення гідроксипроліну (оксипроліну) у сечі.
Принцип методу:метод базується на окисненні гідроксипроліну до сполуки, близької за будовою до піролу, яка при конденсації з реактивом Ерліха (п-диметиламінобензальдегід) дає рожев
Теоретичні питання
1. Потреби організму людини в поживних речовинах – вуглеводах, ліпідах, білках. Енергетична цінність основних поживних речовин. Раціональне харчування. Азотистий баланс організму. Вміст поживних ре
Приклади тестів та ситуаційних задач по засвоєнню практичних навичок
1. у шлунковому соку пацієнта при дослідженні виявлена молочна кислота. Для її виявлення використали...
A. Бензидинову пробу
B. Реакцію Уффельмана
C.
Новости и инфо для студентов