Генетика онтогенеза. Регуляция работы генов как механизм дифференциации клеток. Возможные механизмы канцерогенеза.

I. Методы исследования тонкой структуры клеток:

1 – электронная микроскопия

• Просвечивающий микроскоп
• Сканирующий микроскоп
• Высоковольтный микроскоп

2 – цитохимический анализ – ряд красочных приемов, направленных на выделение специфических химических веществ.

3 – авторадиография – регистрация веществ , меченных изотопами. Необходим для выяснения локализации мест синтеза биополимеров, для определения путей переноса веществ в клетке, для наблюдения за миграцией или свойствами отдельных клеток.

4 – метод дробного фракционирования– позволяет получить в виде отдельных фракций разнообразные клеточные компоненты и изучить их химию, ультраструктуру и свойства.

II. Методы анализа ДНК:

1 – выделение– отбирают слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, и с помощью детергентов производят быстрый лизис клеток. Обычная процедура лизиса включает:

• Механическое разрушение (например, измельчение, гипотонический лизис, мягкое центрифугирование).
• Химическую обработку (например, лизис с помощью детергентов, хаотропных агентов, или тиоловое восстановление).
• Ферментативное расщепление белков (например, с помощью протеиназы К)

Экстрагирование и удаление из раствора фрагментов белков, углеводов, липидов чаще всего производят с помощью фенольной, а затем хлороформной очисткой. При необходимости процедуру повторяют. В дальнейшем молекулы ДНК концентрируют путем осаждения в этаноле. При необходимости использование образца ДНК ее осаждают с помощью высокоскоростного центрифугирования, сливают спирт и растворяют в буферном растворе.

2 – электрофорез - это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме. Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Гель помещается в камеру с буферным раствором, в котором суммарный заряд ДНК отрицателен, так что при подключении электрического тока фрагменты начинают двигаться в геле от катода к аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее. Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.

3 – рестрикция – это метод разделения ДНК на фрагменты. Здесь используется специфические ферменты рестриктазы, которые выделяются из бактериальных клеток. Их примерно 20 видов, которые отличаются друг от друга специфическим сайтом рестрикции (определенная нуклеотидная последовательность, которая узнается рестрикцией). Данный метод рестрикции для различных целей:

Ø Идентификации подвидов, видов

Ø Установление родства между видами и т. д.

4 – секвенирование – это метод определения нуклеотидной последовательности ДНК. Секвенирование проводят на аппаратах секвинаторах. Существует 2 основных метода секвенировния:

Ø Сензиматический (ферментативный или метод Сэнджера)

Ø Химический (рестракционный или метод Максама-Гильберта)

5 – ДНК – зонд – идентификация специфических участков в протяженных молекулах ДНК. Зондом может служить любая однонитевая ДНК ограниченного размера. При добавлении такой молекулы к пулу разнообразных однонитевых ДНК и обеспечении условий для гибридизации ДНК-зонд образует двунитевую структуру только с одной молекулой ДНК и только в том месте, где он найдет комплементарную последовательность.

Клонирование. Последовательности ДНК предварительно клонируют, чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неограниченном количестве. Клонирование предполагает встраивание (инсерцию) чужеродной (экзогенной) ДНК в векторную молекулу ДНК и введение этой конструкции в клетки хозяина.

Векторные системы.В качестве клонирующих векторов используют модифицированные плазмиды, фаги, ретровирусы, аденовирусы, а также некоторые другие генетические конструкции.

6 – гиридизация – объединение 1-нитевых структур в 2-нитевые структуры по принципу комплементарности.

7 – библиотека генов представляет с собой набор клонированных фрагментов ДНК, полностью перекрывающих исходную молекулу ДНК, выделенную из какого-либо источника.

8 – полимеразная цепная реакция - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). (Для идентификации фрагмента ДНК, прибор-амплификатор).

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК.