Макромолекулы в гравитационном поле ультрацентрифуги

Стандартным способом определения массы частицы является сравнение её относительного ускорения под действием силы известной величины с ускорением частицы-стандарта с известной массой. Действие силы тяжести Земли на биологические макромолекулы настолько мало, что перевешивается силами, возникающими от соударений между молекулами в результате их хаотического движения. Сравним гравитационную потенциальную и тепловую энергии. Для этого вычислим разницу в значении гравитационной потенциальной энергии между двумя точками, отделенными друг от друга вертикально расстоянием h для молекулы с молекулярной массой M.

Допустим, что молекулярная масса частицы M = 10⁵ Дa, and h = 1 см. Тогда M = 10⁵/(6.03.10²⁶) = 1.6·10^{-22 кг (при использовании числа молекул в кг-молях). Ускорение, обусловленное гравитацией Земли (}g) равно 10 м·сек^-2, а разница потенциальной энергии E_p, будет равна: E_p = mgh =1.6·10^-22·10·10^-2 = 1.6·10^-23 Джоуля (J). Тепловая энергия ~kT (где Т абсолютная температура) и при комнатной температуре она будет равна: kT = 1.38·10^-23 J/^oK 293 ^oK = 400·10^-23 J. Отсюда следует, что гравитационная потенциальная энергия меньше тепловой энергии в 250 раз, и, следовательно, экспериментальное определение седиментации такой частицы, обусловленное гравитацией поля земли, невозможно.

Эти вычисления показывают, что на молекулярном уровне тепловая энергия намного превосходит гравитационную потенциальную энергию и, следовательно, направленное движение молекул в гравитационном поле Земли невозможно. Одним из способов обойти эту трудность является повышение эффективной гравитационной потенциальной энергии до значений больше, чем kT, путем перенесения частиц в ячейку, вращающуюся с высокой скоростью.

Рассмотрим частицу массой m и плотностью ρ₀. находящуюся в секторной ячейке, которая находится в роторе, вращающемся вокруг z – оси, с угловой скоростью ω, и движущуюся через растворитель с плотностью ρ₀. Здесь мы ограничимся двухкомпонентными системами, в которых присутствуют только один тип молекул растворенного вещества и растворитель. Более сложные случаи многокомпонентных систем будут рассмотрены отдельно.

В простом случае на молекулу в растворителе действует три силы: гравитационная F_c, выталкивающая, F_b, и сила сопротивления среды, F_d (рис. 24.1).

 

Рис. 24.1. Три силы, действующие на частицу в ячейке центрифуги

 

Гравитационная сила в ультрацентрифуге пропорциональна массе частицы m и ее линейному ускорению ω²r:

F_c = mω²r (24.1)

где r ‒ расстояние от оси вращения. Под влиянием этой силы частица будет двигаться в окружающей её среде по направлению от оси вращения. Выталкивающая сила согласно закону Архимеда равна по величине весу жидкости, вытесняемой частицей:

F_b = – m₀ ω²r (24.2)

Имеется строгое определение архимедовых сил, действующих на индивидуальные молекулы: «на тело, помещенное в жидкость, действует выталкивающая сила равная весу жидкости в таком объеме, который становится недоступным его молекулам». Под недоступным объемом в данном контексте понимается исключенный объем или ко-объем.

Результирующая суммарная «гравитационная» сила равна:

F_c + F_b = (m - m₀) ω²r = mω²r (1 - ρ₀/ρ) (24.3)

Выражая величину плотности частицы, ρ, её обратной величиной, парциальным удельным объемом, , мы получаем:

F_c+F_b = mω²r (1 -ρ₀) (24.4)

И, наконец, третья сила, сила трения, действующая на частицу, зависит от ее скорости, u, и коэффициента трения f как F_d = f u.

Частица достигнет постоянной скорости, когда суммарная сила, действующая на частицу, станет равной нулю, т. е.:

F_c + F_b + F_d = 0 (24.5)

mω²r (1 – ρ₀ ) = f u (24.6)

Умножая уравнение 24.6 на число Авогадро и помещая экспериментально измеряемые параметры в левую часть уравнения, а молекулярные параметры частицы в правую, мы получаем:

s ≡ u/ω²r = M (1– ρ₀)/N_A f (24.7)

Отношение измеренной скорости частицы к ее центрифужному ускорению называется константой седиментации, s. Её размерность – секунда. Константы седиментации большинства биологических частиц очень малы, и для удобства за единицу константы седиментации принимается 1×10^-13 сек. Такая единица называется 1 Сведберг (1 S), в память фундаментального вклада Теодора Сведберга в создание метода аналитического ультрацентрифугирования.