Определение седиментационных и дифузионных коэффициентов из данных скоростной седиментации

Простые системы: метод средней точки

В стандартном эксперименте по скоростной седиментации ячейка центрифуги вначале содержит раствор, концентрация которого постоянна по всей ее длине. В процессе центрифугирования частицы движутся под действием гравитационной силы, мениск осветляется и формируется движущаяся граница (рис. 24.12). За скорость движения границы u стандартно принимается изменение радиальной координаты в средней точке. Значение скорости u можно представить как , где w – угловая скорость, s – константа седиментации.

Рис. 24.12. Гипотетическая граница седиментации, показывающая мениск, эквивалентный положению границы, плато и базовую линию. Традиционное рутинное определение константы седиментации базируется на графическом представлении логарифма радиального положения средней точки границы седиментации от времени

 

После интегрирования получаем:

(24.17)

Построение зависимости от позволяет вычислить константу седиментации макромолекул.

Заметим, что этот метод применим только для «идеальных» растворов, то есть для растворов содержащих одинаковые и невзаимодействующие макромолекулы. В случае смеси, содержащей два типа макромолекул, которые имеют большие молекулярные массы (100 кДа и более) и достаточно сильно различаются между собой по молекулярной массе, можно вычислить две константы седиментации, характеризующие каждый тип молекул по отдельности. Однако в общем случае, когда молекулярно-весовое распределение заранее неизвестно, применение метода «средней точки» может приводить к большим ошибкам и в современной практике аналитического центрифугирования не используется. Кроме того, в качестве обязательного условия метод требует наличия на седиментограмме четкого плато и базовой линии, что затрудняет его применение к белкам с молекулярной массой меньше 30 кДа.

На рисунке 24.13 показан симулированный (расчетный) пример влияния молекулярных размеров частиц в системе мономер-димер для визуальной регистрации наличия димеров при соотношении мономер-димер 80:20.

Рис 24.13. Расчетный пример влияния молекулярных размеров частиц в системе мономер-димер для визуальной регистрации наличия димеров при соотношении мономер-димер 80:20. а) 150 кДa, 6.0 S мономер и 300 кДа 9.0 S димер; б) 75 кДа, 4 S мономер и 150 кДa, 6.0 S димер; в) 25 кДа, 2.0 S мономер и 50 кДа, 3.0 S димер. Скорость 50 000 об/ мин, температура 20^оС. Уровень шума в расчетах 0.005 Интервалы между сканами разные

 

Как видно из рисунка 24.13 а димеры видны на седиментационном профиле при массе мономера в 150 кДа (константа седиментации s = 6 S) и не видны при массе мономера 25 кДа (константа седиментации s = 2 S). Объяснение этому факту простое: для маленьких частиц диффузия размывает границу раньше, чем проявится различие в константах седиментации мономера и димера.

Заметим, что для грубой характеристики полидисперсных систем наиболее подходящим является метод вторых моментов, дающий седиментационный коэффициент весового усреднения. Метод вторых моментов является очень удобным методом для точной оценки распределения коэффициентов седиментации в случае слабо асимметричной популяции в смеси. Его использование позволяет вычислить положение гипотетической границы. По скорости перемещения положения этой границы можно найти средневесовой коэффициент седиментации. Метод второго момента наиболее удобен в применении к данным, полученным из кривых dC/dx от x (шлиреновскaя оптическaя системa), по которым вычисляется положение эквивалентной границы (второй момент кривой градиента показателя преломления).

Сложные системы: комплексный анализ седиментационной границы

Анализ данных скоростной седиментации сложных систем требует более трудоемких подходов для анализа параметров по сравнению с методом средней точки. В случае очень больших частиц, для которых разделение достигается в течение времени эксперимента, анализ с высоким разрешением может быть выполнен рутинным методом средней точки. Хороший пример такого случая, когда константы седиментации двух рибосомных субчастиц (50S и 30S) легко вычисляются из седиментационного профиля в их смеси. Однако для малых частиц диффузионное расширение создает большие трудности в решении задачи о распределения компонентов, делая невозможным разделение компонентов, отличающихся по константе седиментации в таком же отношении, как и для рибосомных частиц. Методы Стаффорда или ван Хольде-Вайшета, описанные ранее в этой Лекции, являются очень удобными для работы в этих режимах. Хотя каждый из них имеет свои достоинства и недостатки, однако главное их особенность очевидна: они являются безмодельными, то есть не требуют никакого априорного знания о параметрах седиментирующих компонентов.

Однако если допустить, что имеются заранее известные сведения о параметрах компонентов в смеси, (такой подход мы будем называть модельным), то такой анализ может обеспечить гораздо более высокую точность в распределении, хотя математическая обработка при этом гораздо более сложная, чем в методах Стаффорда или ван Хольде-Вайшета.

Программа для анализа частиц, имеющих непрерывное распределения по размерам, называется SEDFIT.

В программе SEDFIT проблема устойчивости достигается наложением физически разумного ограничения на решение положительностью получаемых величин. Кроме того, добавляется стабилизирующий член, называемый регуляризационным. Проблема однозначности требует введение априорного знания парциального удельного объема и гидродинамической формы частицы, вычисляемой как отношение ее реального коэффициента трения к минимальному f/f_мин. Для сферической белковой частицы с общепринятой величиной гидратации (0,3 грамм воды на грамм белка) это отношение равно 1,2. Для большинства глобулярных белков это отношение равно 1,25-1,35, свидетельствуя об их малой асимметрии. Поскольку для белков парциальный удельный объем можно достаточно точно рассчитать из аминокислотной последовательности, то именно отношение f/f_мин чаще всего используется как подгоночный параметр. Заметим, что отношение f/f_мин не тождественно отношению f/f_0, которое отражает геометрический эффект отличия формы частицы от сферы. Для сферической частицы f/f₀= 1.0.

На рисунке 24.14 приведено несколько примеров, описывающих применение программы SEDFIT для исследования изолированных белков и их смесей.

Рис. 24.14. Примеры применения программы SEDFIT для исследования изолированных белков и их смесей. а) Седиментограмма бычьего сывороточного альбумина. Молекулярная масса, рассчитанная из первичной структуры, составляет 66,43 кДа (w = 40000 об·мин^-1). б), в), г) Восстановленные распределения в координатах с(s) от s и с(М) от М. б) Седиментограмма смеси из двух белков, состоящей из бычьего сывороточного альбумина и бычьей карбоангидразы (w = 50.000 об·мин^-1). в) Седиментограмма смеси из трех белков, состоящей из бычьего сывороточного альбумина, карбоангидразы и апоцитохрома (w = 50000 об·мин^-1) г) Седиментограмма смеси двух белков, состоящей из бычьего сывороточного альбумина и яичного овальбумина (w = 50000 об^·мин^-1). Прерывистой линией указано положение молекулярных параметров для индивидуальных белков

 

Из него видно, что с помощью программы SEDFIT можно разрешать дискретные компоненты смеси, отличающиеся по молекулярной массе в два раза и больше. В том случае, если это отношение меньше двух, (смесь овальбумина и бычьего сывороточного альбумина, отношение молекулярных масс этих двух белков равно 1,55) программа SEDFIT не разделяет компоненты смеси, кроме визуализации димеров BSA, как и в предыдущих случаях (рис. 24.14 нижняя правая четверть). Основной пик является сложным, его параметры близки к средним значениям для двух компонентов смеси. Следует заметить, что во всех экспериментах, проведенных на смесях, исследованные белки имеют близкие величины парциальных удельных объемов и не взаимодействуют друг с другом.