1. Получение исходного генетического материала – гена , кодирующего интересующий белок( признак)
· Необходимый ген может быть получен двумя способами : искусственный синтез или выделение природных генов
· Искусствееный синтез генов вне организма возможен двумя способами :
q Ферментативный синтез - « вырезание » необходимого гена из донорской ДНК клеток интересующего организма с помощью специальных ферментов – рестиктаз
v Рестриктазы – ферменты , относящийся к классу гидролитических ферментов ( гидролаз ) , а именно к группе нуклеаз или эндонуклеаз – ферментам гидролизующим связи нуклеиновых кислот ( ДНК и РНК ) внутри полимерной цепи по строго определённым последовательностям нуклеотидов ; в настоящее время известно около 500 рестриктаз , специфичных к определённым триплетам
v Каждая рестриктаза режет молекулу ДНК только в том месте , где находится определённый триплет , который она может узнавать из множества других ; в результате двойная нить ДНК разделяется на участки ( гены )
v При разделениии ДНК образуются её фрагменты ( гены ) , имеющие однонитевые , так называемые « липкие концы » , имеющие комплементарные основания , которые в присутствии другого фермента могут соединяться ( слипаться ) с комплементарными им « липкими » концами другой ДНК , предварительно разрезанной рестриктазами
v Рестриктаза узнаёт свой триплет в молекуле ДНК любого происхождения – будь то одноклеточные организмы , растения , животные или человек , поэтому образованные липкие концы у молекул ДНК ( генов ) разного происхождения будут оканчиваться на одинаковые триплеты и способны комплементарно соединятся
q Химический
а ) искусственный синтез гена in vitro из отдельных нуклеотидов ( впервые синтезирован индийцем Г. Кораной в 1970 году )
б ) копирование соответствующих матриц РНК ( при этом используется фермент обратная транскриптаза , катализирующий реакции синтеза ДНК на м-РНК )
v Из клеток выделяют и-РНК , являющуюся транскрипционной копией нужного гена , и с помощью фермента – обратной транскриптазы синтезируют комплементарную ей цепь ДНК ; затем и-РНК , спаренную с цепью ДНК , уничтожается специальным ферментом , а оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза комплементарной второй цепи ДНК ; получившаяся двойная спираль ДНК называется к-ДНК ( комплементарная ДНК ) и является искомым геном ( к-ДНК не имеет интронов как все бактериальные гены )
v Искусственно синтезированы гены глобина человека , кролика , голубя , гены синтеза человеческого инсулина и сомато статина , гены митохондрии печени крыс и др.
2. Выделение ДНК - вектора и его рестрикция ( разрезание )
· Вектор – фрагмент ДНК , с помощью которого осуществляется перенос какого-либо гена в клетку - хозяина
· В качестве вектора используют плазмиду или вирус
v Плазмиды – мелкие кольцевые двуцепочечные молекулы внехромосомной ДНК в клетках прокариот ( бактерий ) ; как правило несут гены , контролирующие признаки не связанные с жизненно важными функциями и способные самосотоятельно реплицироваться ; при создании определённых условий в одной клетке можно получить тысячи копий плазмид ; плазмиды способны проникать в другие клетки , преодолевая их мембраны
· Плазмиду ( векторную кольцевую ДНК ) разрезают ( рестрикциируют ) в одной точке , превращая её из кольцевой структуры в линейную
Рестрикция – разрезание ДНК рестрикционной эндонуклеазой на фрагменты с « липкими » концами
· У обоих молекул ДНК , т.е. у плазмиды и выделенного гена получены одинаковые липкие концы , вследствие использования одного вида рестриктаз
3. Смыкание выделенного гена с ДНК вектора с целью получения гибридных молекул ДНК - лигирование
Лигирование – соединение фрагмента ДНК ( гена ) с ДНК плазмиды ферментом лигазой с образованием кольцевой рекомбинантной ДНК ( вектора-плазмиды )
· Воссоединение плазмиды и с выделенным геном происходит в отдельной пробирке благодаря имеющимся на их липких концах комплементарных азотистых оснований
· Выделенный ген встраивается ( « вшивается » ) в место разреза плазмиды , а липкие концы замыкают линейную молекулу в кольцо ; в результате образуется вектор , представляющий уже рекомбинантную молекулу ДНК ( молекулу ДНК , содержащую инородный ген , называют ещё химерной молекулой )
· Чтобы сомкнуть выделенный ген с ДНК-вектора , используют ферменты – лигазы ( ДНК – лигаза которые помогают липким концам соединиться
v Лигазы – класс ферментов , катализирующих реакции присоединения двух различных молекул ДНК друг к другу , а также восстановление её нормальной структуры после частичного повреждения
3. Трансформация или трансгенез – введени рекомбинантных плазмид-векторов в обработанные бактериальные клетки
· Вектор-плазмида ( рекомбинантная ДНК ) используется в качестве переносчика встроенного в него гена в клетку другого организма ( бактериальную или животную клетку-реципиент ) , где на его основе будет осуществляться синтез белка по технологии микробиологического синтеза ( являясь молекулой ДНК плазмида-вектор может успешно работать в клетке-реципиенте , когда в неё встроены чужие гены , изъятые из клеток растений , животных и даже человека ; такие клетки и организмы называются трансгенными или химерными )
v Наиболее часто в качестве клетки-реципиента используется клетки кишечной палочки Е . coli или дрожжей ; начинается молекулярное клонирование – получение колонии бактериальных клеток , содержащих молекулу рекомбинантной ДНК и синтезирующих заданный белок ( все потомки трансфомированной бактерии называются клоном ) ; с помощью клонирования можно получить более миллиона копий любого необходимого гена человека или другого высшего организма
v С целью повышения проникновения рекомбинантных молекул ДНК в клетки их подвергают кратковременному воздействию сильного электического тока , которое создаёт полости в мембранах и делает их на короткое время проницаемыми
v Трансформированные бактерии вместе высевают на питательную среду ( агар – агар ) , на которой они размножаются , образуя клониальные колонии
Скрининг – отбор среди колоний - клонов трансформированных бактерий , содержащих рекомбинантную ДНК
v Так создаются новые высокопродуктивные штаммы бактерий или соматических клеток , синтезирующих белки , имеющие коммерческую ценность , которые передаются в микробиологическую промышленность
v Сегодня накапливаются клонированные гены ДНК тканей человека иряда сельскохозяйственных животных и растений ( в том числе и раковых клеток ) ; коллекцию разных клонов называютклонотекой , геномной библиотекой или банком генов ; для полной библиотеки генома человека требуется получить около 800 тыс. разных клонов ; процесс выделения и клонирования генов в значительной степени автоматизирован
· Перенос генов даёт возможность преодолевать межвидовую изоляцию и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим