Виявлення дубильних речовин

Виявлення дубильних речовин проводили у водному витягу, використовуючи наступні реакції.

Реакція з 1% розчином желатини. До водного витягу сировини, що вивчалася, по краплях додавали однакову кількість свіжоприготованого 0,5% розчину желатини і одну краплю 10% розчину кислоти хлоридної для підвищення чутливості реакції [48]. Утворювався осад.

Реакція з 1% розчином хініну гідрохлориду. До водного витягу сировини, що вивчалася, додавали по декілька крапель 1% розчину хініну гідро хлориду [48]. Утворювався білий аморфний осад.

Реакція з розчином залізоамонієвних галунів. До водного витягу сировини, що вивчалася, по краплях додавали розчин залізоамонієвних галунів [48]. З’являлося чорно-зелене забарвлення.

Проведені якісні реакції свідчать про наявність дубильних речовин конденсованої природи в коренях ехінацеї пурпурової.

 

2.3.3.2. Виявлення гідроксикоричних кислот

 

Хроматографічне вивчення I. Гідроксикоричні кислоти вивчали методом ПХ в системі розчинників 2 % кислота оцтова з достовірними зразками гідроксикоричних кислот.

Для хроматографування використовували водні витяжки досліджуваних об’єктів. При хроматографуванні 4 речовини виявили в УФ-світлі блакитну флуоресценцію різної інтенсивності, що підсилювалася при обробці хроматограми реактивом: парами аміаку [83, 89, 90].

В результаті якісного визначення було ідентифіковано кислоти: кавову, кумарову, ферулову, хлорогенову та неохлорогенову.

Хроматографічне вивчення II. Наважку подрібненої сировини (1,0 г) вміщували у колбу ємністю 250 мл і заливали 100 мл 50% спирту етилового. Кип’ятили 45 хв від моменту закипання на водяної бані в колбі зі зворотним холодильником. Потім вміст колби охолоджували і фільтрували в мірну колбу на 250 мл, доводили до позначки 50% спиртом етиловим, розчин А. 20 мл розчину А упарювали насухо, залишок розчиняли у 0,2 мл 50% спирту етилового, 5 мкл розчину наносили на хроматографічну пластинку «Sorbfil», розміром 15 х 15 см, поряд наносили розчини стандартних зразків хлорогенової, кавової та цикорієвої кислот. Пластинку сушили при кімнатній температурі протягом 10 хв, потім поміщали у камеру із сумішшю розчинників толуол : етилацетат : кислота мурашина безводна : вода (2:20:2:1) та хроматогрофували висхідним способом. Після проходження фронту розчинників близько 12 см від лінії старту, пластинку виймали із камери, сушили на повітрі при кімнатній температурі до видалення запаху розчинників і переглядали в УФ-світлі при довжині хвилі 365 нм. При перегляді хроматограми випробуваного розчину виявлялися такі плями: пляма, що світиться, з синьою флуоресценцією з величиною Rf близько 0,67-0,75 (кавова кислота) на рівні плями, що світила, таким же кольором розчин стандартного зразка кавової кислоти; пляма з блакитною флуоресценцією з величиною Rf близько 0,59-0,65 (цікорієвава кислота) на рівні плями, що світиться, таким же кольором розчин стандартного зразка цікорієвої кислоти; пляма з блакитною флуоресценцією з величиною Rf близько 0,17-0,24 (хлорогенова кислота) на рівні плями, що світиться, таким же кольором розчин стандартного зразка хлорогенової кислоти.

На хроматограмі випробуваного розчину можлива наявність додаткових плям, що світяться, на лінії старту.

 

2.3.3.3. Виявлення флавоноїдів

Наявність даної групи речовин визначали у водно-спиртових витяжках, за допомогою загальновідомих якісних реакцій.

Реакція з ферума (III) хлоридом (на фенольні гідроксили). До 1 мл водно-спиртового витягу додавали 10% розчин ферума (III) хлориду []. З’являлося темно-зелене забарвлення.

Реакція з 10% спиртовим розчином лугу. До 1 мл водно-спиртового витягу додавали 10% спиртовий розчин калію гідроксиду []. Вміст пробірки забарвлювався у жовтий колір.

Реакція з 2% спиртовим розчином алюмінію хлориду. До 1 мл водно-спиртового витягу додавали по 1 мл 2% спиртового розчину алюмінію хлориду [23]. З’являлося жовто-зелене забарвлення.

Реакція з розчином плюмбуму ацетату основного. До 1 мл водно-спиртового витягу додавали по 1-2 краплі 10% розчину плюмбуму ацетату основного [23]. Утворювався жовтий осад.

 

2.3.3.4. Виявлення кумаринів

1. Реакція з діазореактивом. До 3-5 мл витягу додавали по 5 крапель 10% розчину калію гідроксиду та нагрівали на водяній бані, потім додавали 3-5 крапель діазотованої сульфанілової кислоти.

Спостереження: в пробірці - темно-червоне забарвлення.

2. Лактонна проба. До 3-5 мл витягу додавали 5 крапель 10% спиртового розчину калію гідроксиду, нагрівали на водяній бані, потім додавали 5-10 мл води очищеної та 10 крапель 10% розчину хлоридної кислоти.

Спостереження: в пробірці з’являвся зеленувато-жовтий аморфний осад.

2.3.4. Виявлення сапонінів

Для проведення якісних реакцій (осадових та кольорових) на сапоніни використовували водні та водно-спиртові витяжки [23].

1. Осадові реакції.

1.1. До 1 мл спирто-водного витягу додавали 1 мл 1 % спиртового розчину холестерину. Відсутність осаду.

1.2. До 1 мл спирто-водного витягу додавали 3-4 краплі баритової води. Утворювалася каламуть.

1.3. До 1 мл спирто-водного витягу додавали 3-4 краплі 10 % розчину плюмбуму ацетату. Утворювався жовтуватий осад.

2. Кольорові реакції.

2.1. Реакція Лафона. До 2 мл спирто-водного витягу додавали 1 краплю розчину купруму сульфату, 1 мл кислоти сульфатної концентрованої і обережно нагрівали. З`являлося синьо-зелене забарвлення.

2.2. Реакція Сальковського. До 2 мл спирто-водного витягу додавали 1 мл хлороформу і 5-6 крапель кислоти сульфатної концентрованої. З`являлося червоне забарвлення.

3. Визначення хімічної природи сапонінів. У дві мірні пробірки: № 1 – вміщували 5 мл 0,1 н розчину кислоти хлоридної; № 2 – 5 мл 0,1 н розчину натрію гідроксиду. До кожної пробірки додавали по 3 краплі водного витягу з коренів ехінацеї пурпурової і інтенсивно струшували протягом 1 хв. В обох пробірках стовпчик піни був однаковий за об`ємом та стійкістю, що свідчило про тритерпенову природу сапонінів.

Проведені якісні реакції свідчать про наявність сапонінів тритерпенової природи в коренях ехінацеї пурпурової.

2.4. Числові показники

2.4.1. Визначення втрати у масі при висушуванні сировини

Визначення втрати у масі при висушуванні сировини проводили у 5 серіях сировини за методикою ДФУ І видання. Доповнення 2 [31]. Втрата у масі при висушуванні сировини не перевищувала 10 %.

2.4.2. Визначення вмісту золи загальної

Визначення вмісту золи загальної у 5 серіях сировини проводили за методикою ДФУ І видання. Доповнення 1 [30]. Вміст загальної золи не перевищував 10%.

2.4.3. Визначення золи, нерозчинної у 10% розчині кислоти хлоридної

Визначення золи, нерозчинної у 10% розчині кислоти хлоридної, на 5 серіях сировини проводили за методикою ДФУ І видання. Доповнення 2 [31]. Вміст золи нерозчинної у 10% розчині кислоти хлоридної, не перевищував 3%.

2.4.4. Визначення вмісту екстрактивних речовин

Визначення вмісту екстрактивних речовин в сировин проводилося за методикою ДФ СРСР XI видання [17]. Результати представлені в таблиці 2.1.

 

2.4.5. Визначення подрібненості сировини

Подрібненість сировини характеризується розміром, поверхнею та ступенем зруйнування тканини. Цей показник необхідний для оцінки якості подрібненої сировини до екстракції та при розрахунку констант масопередачі.

Для визначення середнього розміру часток проводили ситовий аналіз сировини, за результатами якого визначали середньозважений діаметр (розмір часток) за формулою:

де a₁ – вміст кожної фракції, %;

d₁ – середній розмір часток кожної фракції, мм.

Середній розмір часток кожної фракції визначали як половину суми розмірів сит, через які кожна фракція пройшла і на якому затрималась, тобто як половину суми найбільшого та найменшого розмірів часток:

Результати визначення подрібненості коренів ехінацеї пурпурової наведені в таблиці 2.1.

2.4.6. Сторонні домішки

Не більше 3 %.

 

2.4.7. Визначення питомої маси

Питома маса (d_n) - відношення маси абсолютно сухої подрібненої сировини до об’єму рослинної сировини.

Близько 5,0 г (точна наважка) подрібненої сировини вміщували в пікнометр місткістю 100 мл, заливали дистильованою водою на 2/3 об’єму і витримували на киплячій водяній бані протягом 1,5–2 години, періодично перемішуючи з метою повного видалення повітря з сировини. Після цього пікнометр охолоджували до 20⁰С, доводять об’єм до мітки дистильованою водою. Таким чином, визначали вагу пікнометра з сировиною і водою.

Попередньо визначали вагу пікнометра з водою.

Питому масу розраховували за формулою:

, г/см³

де P – маса абсолютно сухої подрібненої сировини, г;

G – маса пікнометра з водою, г;

F – маса пікнометра з водою і сировиною, г;

d_ж – питома маса води, г/см³ (d_ж = 0,9982 г/см³).

Результати визначення питомої маси коренів ехінацеї пурпурової наведені в таблиці 2.1.

2.4.8. Визначення об’ємної маси

Об’ємну масу визначають як співвідношення не подрібненої сировини при природній або заданій вологості до її повного об’єму, який включає пори, тріщини і капіляри, заповнені повітрям.

Близько 10,0 г (точна наважка) подрібненої сировини швидко занурювали в мірний циліндр з рідиною (вода очищена) і визначали об’єм. За різницею об’ємів в мірному циліндрі визначали об’єм, який займає сировина.

Об’ємну масу розраховували за формулою:

г/см³

де P₀ – маса не подрібненої сировини при даній вологості, г;

V₀ – об’єм, який займає сировина, см³.

Результати визначення об’ємної маси коренів ехінацеї пурпурової наведені в таблиці 2.1.

 

2.4.9. Визначення насипної маси

Насипну масу (d_н) визначають як відношення маси подрібненої сировини при природній вологості до зайнятого сировиною повного об’єму, який включає пори частинок і пустоти між ними.

В мірний циліндр завантажували подрібнену сировину, злегка струшуючи для вирівнювання сировини, і визначали повний об’єм, який вона займає. Після цього сировину зважували.

Насипну масу розраховують за формулою:

,

де Р_н – маса неподрібненої сировини при даній вологості, г;

V_н – об’єм, який займає сировина, см³.

Результати визначення насипної маси коренів ехінацеї пурпурової наведені в таблиці 2.1.

Визначивши об’ємну, питому і насипну ваги, можна розраховувати пористість, порізність і вільний об’єм шару сировини, що дає можливість виявити необхідні співвідношення сировини та екстрагенту.

 

2.4.10. Визначення пористості сировини

Пористість характеризує величину пустот всередині частинок сировини і визначається як відношення різниці між питомою масою і об’ємною масою до питомої маси.

Пористість розраховують за нижче наведеною формулою:

де d_y – питома маса сировини, г/см³;

d_o – об’ємна маса сировини, г/см³.

Результати визначення пористості коренів ехінацеї пурпурової наведені в таблиці 2.1.

2.4.11. Визначення порізності шару

Порізність шару характеризує величину пустот між частинками рослинного матеріалу, визначається як відношення різниці між об’ємною і насипною масами до об’ємної маси.

Порізність розраховують за нижче наведеною формулою

де d₀ - об’ємна маса сировини, г/см³;

d_н – насипна маса сировини, г/см³.

Результати визначення порізності коренів ехінацеї пурпурової наведені в таблиці 2.1.

2.4.12. Визначення вільного об’єму шару

Вільний об’єм шару характеризує відносний об’єм пустот в одиниці шару сировини (пустоти всередині частинок і між ними) і визначається як відношення різниці між питомою вагою і насипною масою до питомої ваги.

Вільний об’єм шару розраховували за нижче приведеною формулою:

V =

де d_у - питома маса сировини, г/см³;

d_н - насипна маса сировини, г/см³.

Результати визначення вільного об’єму шару коренів ехінацеї пурпурової наведені в таблиці 2.1.

 

2.4.13. Розрахунок коефіцієнту поглинання екстрагенту

Коефіцієнт поглинання характеризує кількість розчинника, що заповнює міжклітинні пори, вакуолі, повітряні порожнини в сировині та не вилучається зі шроту. Коефіцієнт поглинання розраховували за різницею об’єму, яким залили відому наважку сировини, та об’ємом, що отримали після зливу, віджавши шрот.

Розрахункова формула приведена нижче

де V_п – об’єм заливу, мл;

V_з – об’єм, що отримали після зливу, мл;

P – маса абсолютно сухої подрібненої сировини, г.

Результати визначення коефіцієнту поглинання екстрагенту коренів ехінацеї пурпурової наведені в таблиці 2.1.

Таблиця 2.1.

Результати визначення технологічних параметрів коренів ехінацеї пурпурової

Технологічні параметри	Значення
Втрата у масі при висушуванні, ,	9,31±0,03
Вміст загальної золи	9,80±0,03
Вміст екстрактивних речовин (екстрагент 70% спирт)	20,14±0,01
Подрібненість	1,5-3 мм
Сторонні домішки	Не більше 3 %
Питома маса	1,54
Об’ємна маса	0,54
Насипна маса	0,32
Пористість	0,63
Порізність	0,62
Вільний об’єм шару	0,76
Коефіцієнт поглинання екстрагенту	5,4

 

2.4.14. Визначення кількісного вмісту діючих речовин в коренях ехінацеї пурпурової

2.4.14.1.Кількісне визначення загального вмісту полісахаридів

Кількісне визначення полісахаридів проводили за відомою методикою [28]. 20 г подрібненої сировини переносили у колбу зі шліфом ємністю 250 мл та додавали 200 мл води. Колбу приєднували до зворотного холодильнику та кип’ятили на водяній бані при перемішуванні протягом 30 хв. Екстракцію в колбі проводили ще двічі, використовуючи перший раз 200 мл, другий раз 100 мл води. Водні витяжки об’єднували, центрифугували і декантували у мірну колбу ємністю 500 мл крізь 5 шарів марлі, що була вкладена в скляну лійку діаметром 55 мм і попередньо промита водою. Фільтр промивали водою і доводили об’єм водою до позначки (розчин А).

25 мл розчину А переносили у центрифужну пробірку, додавали 75 мл 95% спирту, перемішували, підігрівали на водяній бані до 30ºС протягом 5 хв. Через 1 год вміст пробірки центрифугували з частотою обертання 5000 об/хв протягом 30 хв. Надосадову рідину з розчину А фільтрували під вакуумом при залишковому тиску 13-16 кПа, через висушений до постійної маси при температурі 100-105ºС скляний фільтр ПОР-16 діаметром 40 мм. Осад з розчину кількісно переносили на фільтр, послідовно промивали 15 мл розчинами 95% спирту етилового у воді (у відношенні 3:1), 10 мл ацетону та 10 мл діетилового етеру. Фільтри з осадом висушували на повітрі, а потім при температурі 100-105ºС до постійної маси. Вміст полісахаридів у перерахунку на абсолютно суху сировину у відсотках (Х) обчислювали за формулою:

,

де m₁ – маса фільтру, г;

m₂ – маса фільтру з осадом, г;

m – маса сировини, г;

W – втрата у масі при висушуванні, %.

Результати кількісного визначення полісахаридів в коренях ехінацеї пурпурової наведено в табл. 2.2.

Таблиця 2.2

Кількісний вміст полісахаридів в коренях ехінацеї пурпурової

m	n	Xi	Хср	S2	Scp	P	t(P,n)	Довірчий інтервал	ε, %
		9,436	9,43	0,001079	0,014692	0,95	2,78	9,43	±	0,04	0,433
9,387
9,462
9,447
9,395

 

Як видно з табл. 2.2, вміст полісахаридів в коренях ехінацеї пурпурової складає 9,43±0,04 %.

 

2.4.14.2. Фракціонування полісахаридів

Після отримання ліпофільної фракції, нами був досліджений шрот та отримані різні фракції полісахаридів – визначено водорозчинні полісахариди (ВРПС), пектинові речовини (ПР) та геміцелюлози А і Б (ГЦ) [38, 54].

100 г шроту сировини, що залишився після отримання ліпофільних фракцій екстрагували 82% спиртом етиловим при нагріванні на водяній бані протягом 2 год, періодично збовтуючи для змивання частинок сировини зі стінок колби. Екстракцію проводили двічі, для очищення сировини від вільних моносахаридів, олігосахаридів та інших спирторозчиних речовин. Отриманні витяжки відділяли від сировини. Повітряно-сухий шрот сировини, що залишився після екстракції 82% спиртом етиловим, використовували для отримання ВРПС. Шрот екстрагували двічі по 1л гарячої води при нагріванні до температури 95°С протягом 2 год кожного разу. Екстракцію проводили при постійному перемішуванні. Отриманні екстракти відділяли від сировини, об'єднували, випарювали до 1/5 від початкового об'єму. Концентровані витяжки ВРПС висаджували трикратною кількістю 96% етанолу за об'ємом при кімнатній температурі. Отримані осади відфільтровували, промивали 96% етанолом, ацетоном, висушували у сушильній шафі до постійної маси та зважували. Отримували фракції ВРПС.

Шрот, що залишився після вилучення ВРПС, використовували для виділення ПР. Екстракцію повітряно-сухого шроту проводили сумішшю 0,5% розчину кислоти щавлевої та 0,5% розчину амонію оксалату у співвідношенні 1:1. Екстрагування відбувалося двічі при температурі 80-85°С протягом 2 год при постійному перемішуванні. Отриманні витяжки відділяли від сировини, об'єднували, екстракти концентрували і висаджували трикратною кількістю 96% етанолу. При цьому утворювався осад ПР, який відфільтровували, промивали послідовно 96% спиртом етиловим, ацетоном, висушували у сушильній шафі до постійної маси та зважували.

Для виділення ГЦ, використовували повітряно-сухий шрот, що залишився після послідовного дослідження ВРПС та ПР. Екстракцію проводили двічі 10 % розчином натрію гідроксиду. Екстрагування відбувалося при температурі 80-85°С протягом 2 год при постійному перемішуванні. Співвідношення сировина-екстрагент 1:5. Витяжки відділяли від сировини, екстракти об'єднували, концентрували до 1:5 від початкового об’єму, висаджували трикратною кількістю 96% спирту етилового. Осад, що випав, відфільтровували, промивали спочатку 96% етанолом, потім ацетоном, висушували у сушильній шафі до постійної маси та зважували.

Результати дослідження вмісту полісахаридів в коренях ехінацеї пурпурової за фракціями наведено в табл. 2.3.

Таблиця 2.3

Результати визначення кількісного вмісту полісахаридних фракцій в коренях ехінацеї пурпурової

Назва сировини	Вміст полісаридної фракції, % (m=5)
ВРПС	ПР	ГЦ
Корені	21,19±0,07	14,90±0,03	19,56±0,02

За результатами фракціонування було визначено, що найбільша кількість полісахаридів представлена водорозчинними полісахаридами (21,19 ±0,07%) [36].