Визначення фенольних сполук

2.4.14.3.1. Кількісне визначення вмісту гідроксикоричних кислот

Для кількісного визначення даної групи речовин використовували спектрофотометричний метод [16, 44, 70, 74].

2,0 г (точна наважка) подрібненої сировини, що проходить крізь сито з отворами діаметром 1 мм, поміщали в колбу ємністю 200 мл і додавали 70 мл води. Колбу приєднували до зворотного холодильнику і нагрівали на водяному огрівнику протягом 15 хв. Екстракцію проводили ще двічі. Екстракти охолоджували і фільтрували через паперові фільтри на воронці Бюхнера. Витяжки кількісно переносили в мірну колбу ємністю 200 мл і доводили об’єм розчину водою до позначки (розчин А).

В мірну колбу ємністю 50 мл вносили 1 мл розчину А і доводили розчин до позначки 20% спиртом етиловим. Оптичну густину отриманого розчину вимірювали на спектрофотометрі при довжині хвилі 327 нм. Розчином порівняння слугував 20% етанол. Аналогічно визначали вміст гідроксикоричних кислот для густого екстракту.

Вміст суми гідроксикоричних кислот в перерахунку на хлорогенову кислоту та абсолютно суху сировину у відсотках (Х) обчислювали за формулою:

,

де А – абсорбція розчину, що досліджувався, нм;

m – маса сировини, г;

W – втрата у масі при висушуванні, %;

– питомий показник поглинання хлорогенової кислоти, який дорівнює 531.

Результати кількісного визначення суми гідроксикоричних кислот в перерахунку на хлорогенову кислоту в досліджуваних зразках наведені в табл. 2.4.

Таблиця 2.4

Кількісний вміст суми гідроксикоричних кислот

в коренях ехінацеї пурпурової

m	n	Xi	Хср	S2	Scp	P	t(P, n)	Довірчий інтервал	ε_, %
		1,350	1,352	0,000054000	0,0032863	0,95	2,78	1,352	±	0,01	0,67
1,349
1,365
1,347
1,349

 

Як видно з табл. 2.4, кількісний вміст суми гідроксикоричних кислот у коренях ехінацеї пурпурової складав 1,35± 0,01%.

 

2.4.14.3.2. Кількісне визначення гідроксикоричних кислот за методикою ДФУ

Вихідний розчин 1. 1,4 г (точну наважку) здрібненої на порошок сировини поміщають у колбу місткістю 200 мл, додають 90 мл спирту (50 % об/об) Р, нагрівають зі зворотним холодильником на водяній бані протягом 30 хв, охолоджують до кімнатної температури та фільтрують у мірну колбу місткістю 100 мл крізь тампон із вати. Тампон промивають 10 мл спирту (50 % об/об) Р і промивну рідину фільтрують у ту саму мірну колбу. Доводять об`єм розчину спиртом (50 % об/об) Р до позначки і перемішують. Одержаний розчин фільтрують крізь паперовий фільтр «синя стрічка», відкидаючи перші 15 мл фільтрату.

Випробуваний розчин. 1 мл вихідного розчину 1 поміщають у мірну колбу місткістю 10 мл, послідовно додають, перемішуючи після кожного додавання, 2 мл 0,5 М розчину кислоти хлоридної, 2 мл свіжоприготованного розчину 10 г натрію нітриту Р і 10 г натрію молібдату Р у 100 мл води Р, 2 мл розчину натрію гідроксиду розведеного Р, доводять об`єм розчину водою Р до позначки та перемішують.

Компенсаційний розчин 1. 1 мл вихідного розчину 1 поміщають у мірну колбу місткістю 10 мл, послідовно додають, перемішуючи після кожного додавання, 2 мл 0,5 М розчину кислоти хлоридної і 2 мл розчину натрію гідроксиду розведеного Р, доводять об`єм розчину водою Р до позначки та перемішують.

Вихідний розчин 2. 0,010 г (точна наважка) ФСЗ ДФУ цикорієвої кислоти поміщають у мірну колбу місткістю 50 мл, розчиняють у 30 мл спирту (50 % об/об) Р , доводять об`єм розчину спиртом (50 % об/об) Р до позначки і перемішують.

Розчин порівняння. 1,0 мл вихідного розчину 2 поміщають у мірну колбу місткістю 10 мл послідовно додають, перемішуючи після кожного додавання, 2 мл 0,5 М розчину кислоти хлоридної, 2 мл свіжоприготованного розчину 10 г натрію нітриту Р і 10 г натрію молібдату Р у 100 мл води Р, 2 мл розчину натрію гідроксиду розведеного Р, доводять об`єм розчину водою Р до позначки та перемішують.

Компенсаційний розчин 2. 1 мл вихідного розчину 2 поміщають у мірну колбу місткістю 10 мл, послідовно додають, перемішуючи після кожного додавання, 2 мл 0,5 М розчину кислоти хлоридної і 2 мл розчину натрію гідроксиду розведеного Р, доводять об`єм розчину водою Р до позначки та перемішують.

Відразу вимірюють оптичну густину випробуваного розчину на спектрофотометрі за довжиною хвилі 525 нм у кюветі із товщиною шару 10 мм відносно компенсаційного розчину 1. Паралельно за тих самих умов вимірюють оптичну густину розчину порівняння відносно компенсаційного розчину 2.

Вміст суми гідроксикоричних кислот у сировині, у перерахунку на кислоту цикорієві, у відсотках, обчислюють за формулою:

А ∙ m₀ ∙ Р ∙ 2

Х = --------------------------- ,

А₀ ∙ m

де: А – оптична густина випробуваного розчину за довжини хвилі 525 нм;

А₀ - оптична густина розчину порівняння за довжини хвилі 525 нм;

m – маса наважки сировини, у грамах;

m_{0 -} маса наважки ФСЗ ДФУ цикорієвої кислоти, у грамах;

Р – вміст кислоти цикорієвої у ФСЗ ДФУ цикорієвої кислоти, у відсотках.

Результати кількісного визначення суми гідроксикоричних кислот у перерахунку на кислоту цикорієві в досліджуваних зразках наведені в табл. 2.5.

Таблиця 2.5

Кількісний вміст суми гідроксикоричних кислот

в коренях ехінацеї пурпурової

m	n	Xi	Хср	S2	Scp	P	t(P, n)	Довірчий інтервал	ε_, %
		2,350	2,352	0,0000549	0,0032877	0,95	2,78	2,352	±	0,01	0,67
2,349
2,365
2,347
2,349

Як видно з табл. 2.5, кількісний вміст суми гідроксикоричних кислот у перерахунку на кислоту цикорієву у коренях ехінацеї пурпурової склав 2,352±0,01 %.

2.4.14.3.3. Кількісне визначення вмісту флавоноїдів

1,0 г (точна наважка) подрібненої сировини до розміру часток, що проходить крізь сито з отворами діаметром 2 мм, вміщували у колбу зі шліфом ємністю 150 мл, додавали 30 мл 50% спирту етилового. Колбу приєднували до зворотного холодильнику і нагрівали на киплячій водяній бані протягом 30 хв, періодично збовтуючи для змивання часток сировини зі стінок колби. Гарячі витяжки фільтрували крізь вату в мірну колбу ємністю 100 мл, так щоб частки сировини не попадали на фільтр. Вату переносили в колбу для екстрагування і додавали 30 мл 50% спирту. Екстракцію повторювали ще двічі в описаних вище умовах, фільтруючи витяжки в ту ж саму мірну колбу. Після охолодження об’єми витяжок доводили 50% спиртом до позначки та перемішували (розчини А).

В мірну колбу ємністю 25 мл переносили 1 мл розчину А, 1 мл розчину алюмінію хлориду у 95% спирті етиловому і доводили об’єм розчину 95% спиртом етиловим до позначки. Через 40 хв вимірювали оптичну густину розчину на спектрофотометрі при довжині хвилі 415 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм. В якості розчину порівняння використовували розчин, який складався з 1 мл витяжки, 1 краплі кислоти оцтової розведеної і доведений 95% спиртом етиловим до позначки у мірній колбі ємністю 25 мл. Аналогічно визначали вміст флавоноїдів в густому екстракті.

Паралельно вимірювали абсорбцію розчину достовірного зразка рутину, який готували аналогічно розчину, що досліджувався [28].

Вміст суми флавоноїдів у перерахунку на рутин і абсолютно суху сировину у відсотках (Х) обчислювали за формулою:

,

де А – абсорбція розчину, що досліджувався, нм;

А ₀ – абсорбція розчину рутину, нм;

m – маса сировини, г;

m₀ – маса рутину, г;

W – втрата у масі при висушуванні сировини, %.

Примітки:

1. Приготування розчину рутину. Біля 0,005 г (точна наважка) ДСЗ рутину, попередньо висушеного при температурі 130-135^ОС протягом 3 год, розчиняли у 85 мл 85% спирту етилового у мірній колбі ємністю 100 мл при нагріванні на водяній бані, охолоджували, кількісно переносили у мірну колбу ємністю 100 мл, доводили об`єм розчину спиртом до позначки.

Термін придатності розчину – 1 місяць.

2. Приготування 2% розчину алюмінію хлориду в 95% спирті етиловому: 2 г алюмінію хлориду розчиняли у 50 мл 95% спирту у мірній колбі ємністю 100 мл, об`єм розчину доводили тим же розчинником до позначки та перемішували.
Термін придатності розчину – 3 місяці.

Результати кількісного визначення суми флавоноїдів в коренях ехінацеї пурпурової в перерахунку на рутин представлені у табл. 2.6.

Таблиця 2.6

Результати кількісного визначення вмісту флавоноїдів в коренях ехінацеї пурпурової

m

n

Xi

Хср

S2

Scp

P

t(P, n)

Довірчий інтервал

ε_, %

		0,345	0,347	0,0000038	0,0008718	0,95	2,78	0,3474	±	0,002	0,697
0,348
0,348
0,350
0,346

 

У результаті дослідження було встановлено, що кількісний вміст флавоноїдів в абсолютно сухій сировині в перерахунку на рутин складає 0,35± 0,002%.

2.4.14.3.4. Визначення кількісного вмісту окиснюваних поліфенолів

Визначення кількісного вмісту суми окиснюваних поліфенолів проводили перманганатометричним методом за Левенталем [28].

2 г (точна наважка) подрібненої сировини, що проходить крізь сито з діаметром отворів 3 мм, поміщали у колбу ємністю 500 мл, додавали 250 мл нагрітої до кипіння води. Колбу приєднували до зворотнього холодильнику і нагрівали на водяній бані протягом 30 хв при періодичному помішуванні. Екстракт охолоджували до кімнатної температури і фільтрували біля 100 мл у колбу ємністю 200-250 мл крізь вату так, щоб частки сировини не попадали у колбу. Потім відбирали піпеткою 25 мл отриманого екстракту в іншу конічну колбу ємністю 750 мл, додавали 500 мл води, 25 мл індигосульфокислоти і титрували при постійному перемішуванні розчином калію перманганату (0,02 моль/л) до золотисто-жовтого кольору. Паралельно проводили контрольний дослід.

Вміст суми окиснювальних поліфенолів в перерахунку на танін та абсолютно суху сировину у відсотках (Х) обчислювали за формулою:

 

де V – об’єм розчину калію перманганату (0,02 моль/л), витраченого на титрування екстракту, мл;

V₁ – об’єм розчину калію перманганату (0,02 моль/л), витраченого на титрування контрольного досліду, мл;

0,004157 – кількість дубильних речовин, що відповідає 1 мл розчину калію перманганату (0,02 моль/л) у перерахунку на танін, г;

250 – загальний об'єм екстракту, мл;

m – маса сировини, г;

25 – об'єм екстракту, використаного для титрування, мл;

W – втрата у масі при висушуванні сировини, %.

Результати кількісного визначення суми окиснювальних поліфенолів представлені в табл. 2.7.

Таблиця 2.7

Результати визначення кількісного вмісту суми окиснюваних поліфенолів в коренях ехінацеї пурпурової

m	n	Xi	Хсер

m	n	Xi	Хср	S2	Scp	P	t(P, n)	Довірчий інтервал	ε_, %
		2,600	2,612	0,0003200	0,008	0,95	2,78	2,612	±	0,022	0,851
2,630
2,590
2,630
2,610

 

Таким чином, було визначено, що в коренях ехінацеї пурпурової сума окиснюваних поліфенолів склала 2,612±0,022%.

2.4.14.4. Кількісне визначення вмісту аскорбінової кислоти

Визначення кількісного вмісту вітаміну С проводили за відомою методикою титриметричним методом [28].

До 20,0 г сировини (точна наважка) поступово додавали 300 мл води очищеної і настоювали протягом 10 хв. Потім суміш розмішували і екстракт фільтрували (розчини А). В конічну колбу ємністю 100 мл переносили 1 мл розчину А, додавали 1 мл 2% розчину кислоти хлоридної, 13 мл води очищеної перемішували та титрували з мікробюретки розчином 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію (0,001 М) до появлення рожевого забарвлення, що не зникало протягом 30-60 сек. Титрування продовжували не більше 2 хв. Вміст аскорбінової кислоти в перерахунку на абсолютно суху сировину у відсотках (Х) обчислювали за формулою:

,

 

де V – об'єм розчину 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію (0,001 М), витрачений на титрування, мл;

0,000088 – кількість аскорбінової кислоти, яка відповідає 1мл розчину 2,6-дихлорфеноліндофеноляту натрію (0,001 М), г;

m – маса сировини, г;

W – втрата у масі при висушуванні, %.

Результати кількісного визначення вмісту аскорбінової кислоти в коренях ехінацеї пурпурової наведені в табл. 2.8.

Таблиця 2.8

Результати кількісного визначення вмісту аскорбінової кислоти в коренях ехінацеї пурпурової та в густому екстракті

m	n	Xi	Хср	S2	Scp	P	t(P, n)	Довірчий інтервал	ε_, %
Корені ехінацеї пурпурової
		0,020	0,0208	0,000001700	0,0005831	0,95	2,78	0,0208	±	0,002	7,793291
0,021
0,020
0,023
0,020

Таким чином, вміст аскорбінової кислоти в коренях ехінацеї пурпурової склав 0,0208±0,002 %.

 

2.4.14.5. Визначення кількісного вмісту ефірної олії

 

Кількісний вміст ефірної олії у коренях ехінацеї пурпурової визначали шляхом перегонки із водяною парою з використанням спеціального приладу. Визначення проводили згідно методики описаній в ДФУ, доповнення 1 [30].

За результатами експерименту кількість ефірної олії, що міститься у коренях складає 0,7 %.

2.5. Зберігання сировини

Сировину зберігають не здрібненою.

 

 

Параметри стандартизації коренів ехінацеї пурпурової

№ серії	Макроскопічні ознаки	Мікроскопічні ознаки	Ідентифікація	Вміст вологи	Вміст загальної золи	Вміст золи, не розчин-ної в 10% розчині HCl	Вміст суми полісаха-ридів	Вміст суми гідрокси-коричних кислот
Якісні реакції	Хроматографічне вивчення
	Кореневища різної форми до 15 см завдовжки, легкі. Зовнішня поверхня буруватого або темно-коричневого кольору, на зламі білого кольору або злегка жовтуватого. Чисельні корені спірально скручені, від світло-коричневого до темно-коричневого кольору, із дрібно сітчастою поверхнею. Запах приємний, трояндовий, смак гірко-в`яжучий.	Кореневище на поперечному зрізі безпучкового типу будови. В паренхімі кори зустрічаються великі схизогенні вмістища, овальні за формою, витягнуті в радіальному або тангентальному напрямку. На поперечному зрізі коріня рівномірно по всьому діаметрі зустрічаються склереїди, поодинокі або групами по 2-5 клітин. Склереїди з усіх боків оточені міжклітинниками, невеликими за розмірами та різноманітними за формою. На поздовжньому зрізі ці міжклітинники мають подовжену форму. В них присутні відкладення чорного коліру.	При доданні водної витяжки з сировини в трикратну кількість 95% етилового спирту – утворювався сірий аморфний осад – наявність полісахаридів	Система розчинників: толуол: етилацетат: кислота мурашина безводна : вода (2:20:2:1). Пластинки «Sorbfil». (При перегляді хроматограми в УФ-світлі при довжині хвилі 365 нм з’являються плями на рівні стандартних зразків кавової, цікорієвої та хлоророгенової кислот і мають саме таке забарвлення.	Не більше 12%.	Не більше 9%.	Не більше 3%.	Не менше 7%.	Не менше 1%.