МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ

Доказательства роли ДНК в наследственности. После того как было установлено, что гены находятся в хромосомах и расположены там в определенном порядке, возник вопрос об их химический природе. Ученым было известно, что в состав хромосом высших организмов входят ДНК и несколько типов гистоновых и негистоновых белков. До 40-х годов нашего столетия большинство ученых считали, что гены имеют бел­ковую природу. Русский ученый Н. К. Кольцов высказал мысль, что хромосо­ма это гигантская биологическая молекула, обладающая свойством само­удвоения, и что все свойства и признаки организма обусловлены строени­ем, белка и взаимодействием его молекул. Казалось вероятным, что именно в 6елках заключена наследственная информация о развитии всех признаков и свойств организма. Однако проведенные в последующем эксперименты на микроорганизмах с применением новейших методов исследований позволили установить, что генетическая информация сосредоточена в нуклеиновых кислотах.

Раскрытию ведущей роли ДНК в наследственности предшествовали экс­периментальные работы Ф. Гриффитса (1928), проведенные им по изучению явления трансформации у микроорганизмов. Свои эксперименты он проводил на пневмококках. У этого вида микробов есть два штамма - капсульный (S) и бескапсульный (R). Штамм S вызывает гибель мышей от пневмонии. Он имеет полисахаридную слизистую капсулу и образует гладкие колонии. Штамм R - авирулентный, капсулы не имеет и образует шероховатые коло­нии. Гриффитс заражал мышей смесью живых бескапсульных бактерий R-штамма и убитых нагреванием капсульных пневмококков S-штамма. В итоге мыши заболевали пневмонией и погибали, а выделенные из их тканей клетки бы­ли как S-, так и R-штаммов. Следовательно, произошло превращение (трансформация) бескапсульных бактерий в вирулентные капсульные бакте­рии S-штамма.

В 1944 году американский микробиолог 0. Эвери с сотрудниками пов­торил эксперимент Гриффитса. Из бактерий штамма S он выделил ДНК и внес ее в питательную среду, на которой размножались бактерии авирулентного штамма R. Значительная часть авирулентных бескапсульных бак­терий штамма R трансформировалась в капсульные вирулентные бактерии S -штамма. Это явление дало Эвери основание утверждать о ведущей роли ДНК в переносе наследственной информации от одного штамма бактерий к другому.

Другой эксперимент, подтверждающий роль ДНК в наследственности, провели американские ученые И.Чейз и Херши. Они размножали ДНК-содержащий вирус-бактериофаг на среде, содержащей радиоактивные фосфор и серу Р35 и S33. Радиоактивная сера включилась в серусодержащие белки оболочки фага, а радиоактивный фосфор - в ДНК. Далее мечеными радиоак­тивными изотопами фагами заражали бактерии. С помощью электронного микроскопа было установлено, что радиоактивная сера не проникала в клетку бактерии, внутри клетки был обнаружен только радиоактивный фос­фор. Это свидетельствовало о том, что при заражении бактерии фагом внутрь клетки проникает только ДНК. В зараженной клетке образовалось множество вирионов фага. Следовательно, генетическая информация, необ­ходимая для синтеза ДНК фагов, содержится в ДНК проникших в клетку ви­русов.

Доказательством ведущей роли ДНК в наследственности является и то, что она локализована главным образом в хромасомах, поэтому молекуляр­ная генетика не противоречит хромосомной теории наследственности и за­конам классической генетики.

Строение и синтез ДНК. Нуклеиновые кислоты впервые открыл швейцарский врач Ф. Мишер в 1868 году. Он выделил из ядер клеток особое вещество, обладающее кислыми свойствами, и назвал его нуклеином. Позднее нуклеиновые кислоты были выделены из дрожжей и зобной железы теленка. В период с 1900 по 1932 год был выяснен химический состав ДНК. Было установлено, что в ее сос­тав входят: остатки фосфорной кислоты, углеводный компонент, дезоксирибоза и четыре типа азотистых оснований, два производных пурина (аденин и гуанин) и два производных пиримидина (тимин и цитозин).

В 1950 году Э. Чаргафф при помощи метода распределительной хромотографии выявил очень важные закономерности, касающиеся строения ДНК. Он установил, что в ДНК содержание аденина равно содержанию тимина (А=Т), а содержание гуанина равно содержанию цитозина (А=Ц). Отсюда: (А+Г) : (Т+Ц) = 1, т. е. сумма пуриновых нуклеотидов равна сумме пиримидиновых. Такая закономерность указывают на комплементарное соедине­ние пуриновых и пиримидиновых оснований в молекуле ДНК,

К 1952 году Р. Франклин и М. Уилкинс добились получения высокока­чественных рентгенограмм ДНК. На фотографиях было видно, что ДНК представлена двумя цепями закрученными вокруг собственной оси.

Приоритет в расшифровке структуры молекулы ДНК принадлежит Д. Уотсону и Ф. Крику. Эту работу они завершили в 1953 году. Согласно их мо­дели, молекула ДНК имеет двойную спираль, состоящую из двух нуклеотидных цепей с общей осью. Диаметр двойной спирали ДНК равен 2 нм, а расстояние между витками 3,4 нм. На каждый виток спирали приходится 10 пар нуклеотидов, отсюда расстояние между азотистыми основаниями равно 0,34 нм. Каждая из цепей ДНК является полинуклеотидом и состоит из 4 типов нуклеотидов. В состав нуклеотида входят: дезоксирибоза (Д), остаток фосфорной кислоты (Ф) и одно из четырех азотистых оснований (А,Г,Ц и Т). Соединение пуриновых и пиримидиновых оснований с дезоксирибозой приводит к образованию нуклеозида. При присоединении фосфорно­го остатка к углеводной части нуклеозида образуется нуклеотид. Дезок­сирибоза в нуклеотидах соединяется с основаниями гликозидной связью, а с остатками фосфорной кислоты - эфирными связями.

Азотистые основания нуклеотидов обоих цепей заключены внутри между витками спирали и соединены водородными связями. Причем аденин одной цепи всегда связан только с тимином другой цепи, а гуанин - только с цитозином. Пара А - Т соединена двумя водородными связями, а пара Г-Ц - тремя. Такой порядок азотистых оснований называется комплементарностью. Схему строения молекулы ДНК можно представить следующим образом:

 

Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф

/ / / / / / / / / /

Д Д Д Д Д Д Д Д Д Д Д 1-я цепь

I I I I I I I I I I I

А Г Ц Т Т А Г Г Ц Т А

: : : : : : : : : : :водородные связи

Т Ц Г А А Т Ц Ц Г А Т

I I I I I I I I I I I

Д Д Д Д Д Д Д Д Д Д Д 2-я цепь

/ / / / / / / / / /

Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф

 

Установлено, что расположение азотистых оснований в молекуле ДНК очень изменчиво и характерно для каждого типа. Следовательно, наследс­твенная информация зашифрована различной последовательностью оснований четырех типов. Азотистые основания обеих цепей заключены внутри между витками спирали и соединены водородными связями. Число нуклеотидов и их после­довательность в молекуле ДНК специфичны для каждого вида и частично для каждой особи. Дж. Уотсон ввел понятие о видовой специфичности ДНК. Коэффициентом видовой специфичности называют отношение (А+Т):(Г+Ц).

Репликация ДНК. ДНК является веществом, количество которого строго постоянно во всех клетках организма. ДНК находится в хромосомах, и репликация ее происходит перед каждым удвоением хромосом и делением клетки. На отдельных участках молекулы ДНК образуются так называемые вилки репликации. В этих местах водородные связи между азотистыми ос­нованиями под действием ферментов разрываются, комплементарные нити

разъединяются и каждая из них становится матрицей, на которой происхо­дит синтез дочерних нитей.

 

Схема синтеза молекулы ДНК

 

А Г Ц Т А Г Г

А Г Ц Т А Г Г I I I I I I I

А Г Ц Т А Г Г Т Ц Г А Т Ц Ц

I I I I I I I фермент

Т Ц Г А Т Ц Ц А Г Ц Т А Г Г

Т Ц Г А Т Ц Ц I I I I I I I

Т Ц Г А Т Ц Ц

 

Такой тип репликации ДНК получил название полуконсервативного. Процесс синтеза протекает при участии комплекса ферментов, главнейшим из которых является ДНК-полимераза. Участок ДНК в том месте, где начали расплетаться комплементарные нити, называется вилкой репликации. Она образуется у прокариот в одной определенной, генетически фиксиро­ванной точке. В молекуле ДНК эукариот таких "стартовых точек" бывает несколько. Синтез новых комплементарных цепей при репликации ДНК проис­ходит по частям. Эти отрезки, состоящие из 1000-2000 нуклеотидов, на­зывают фрагментами Оказаки. Структура, способная к репликации (хромосома, плазмида, вирусный ге­ном), называется репликоном. Репликация обеспечивает материальную неп­рерывность наследственного вещества клетки.

Строение, синтез и типы РНК. Многочисленными исследованиями было установлено, что синтез белка в клетке происходит не в ядре, где находится ДНК, а в цитоплазме. Сле­довательно, сама ДНК не может служить матрицей для синтеза белка. В настоящее время выяснено, что молекулами, ответственными за внутрикле­точную транспортировку информации и за преобразование этой информации в последовательность аминокислот в структуре белковой молекулы, явля­ются рибонуклеиновые кислоты (РНК).

Молекулы рибонуклеиновой кислоты имеют одну полинуклеотидную цепь. В состав молекулы РНК входят четыре типа азотистых оснований (аденин, гуанин, цитозин и урацил), сахар рибоза и остатки фосфорной кислоты. По составу от ДНК она отличается тем, что вместо дезоксирибозы содер­жит рибозу и вместо пуринового основания тимина - урацил. Схему строе­ния молекулы РНК можно представить следующим образом:

 

Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф Ф

/ / / / / / / / /

Р Р Р Р Р Р Р Р Р Р

I I I I I I I I I I

А Г Ц У Т У Г Г Ц У

 

где, А,Г,Ц,У - азотистые основания, Р - рибоза и Ф - остатки фосфорной кислоты.

Синтез молекулы РНК происходит на одной из цепей молекулы ДНК. Этот процесс протекает с участием большого числа ферментов и называется транскрипцией. Причем двойная цепь ДНК раскручивается и на одной из ее цепей, которая называется смысловой синтезируется РНК. В упрощенном варианте синтез молекулы РНК можно представить следующим образом:

 

смысловая цепь А Г Ц Т А Г Г

А Г Ц Т А Г Г I I I I I I I

А Г Ц Т А Г Г У Ц Г А У Ц Ц - РНК

I I I I I I I фермент

Т Ц Г А Т Ц Ц

Т Ц Г А Т Ц Ц

 

Молекулярная масса очищенных препаратов РНК колеблется от 20000 до 2000000 Д. В организме существуют три основных типа РНК: информацион­ная ( и-РНК), или матричная (м-РНК), рибосомальная (р-РНК) и транс­портная

(т-РНК).Эти типы РНК различаются по величине молекул и функ­циям.

Информационная РНК. Роль информационной РНК заключается в том, что она переписывает информацию с молекулы ДНК и переносит ее к месту син­теза белка. В рибосомах и-РНК выполняет роль матрицы в процессе био­синтеза белка. Информационная РНК составляет около 5% от всей массы РНК. Это довольно крупные молекулы с молекулярной массой 2 млн Д, сле­довательно, состоит она из сотен и даже тысяч нуклеотидов. В клетках обнаруживается большое разнообразие и-РНК как по составу, так и по величине молекул.

Транспортная РНК. Эти молекулы небольшого размера. В их состав входит 75-200 нуклеотидов. Молекулярная масса. 24-30 тысяч Д. Транс­портные РНК выполняют функцию переноса аминокислот к месту синтеза белка.К настоящему времени обнаружено около 60-ти т-РНК. Молекула

т-РНК напоминает форму клеверного листа. На конце одной цепи находится акцепторный участок - триплет ЦЦА, к которому прикрепляется аминокис­лота. В центре средней петли находится антикодон - триплет, состоящий из трех нуклеотидов комплементарных генетическому коду и - РНК.

Рибосомальная РНК. Молекулярная масса рибосомальной РНК 50-200 тыс. Д. Эта молекула содержит около 6000 нуклеотидов. Рибосомальная РНК синтезируется в ядрышках, затем поступает в цитоплазму. Объединяясь с особыми белками, она образует рибосомы, в которых осуществляется био­синтез белков. Количество рибосомальной РНК составляет около 80 про­центов.

Генетический код. Биосинтез белков в клетке.Генетическая информация зашифрована в ДНК посредством чередова­ния четырех азотистых оснований. Известно также, что наследственную информацию с ДНК считывает и-РНК, которая синтезируется на одной из ее цепей. Однако неясным был вопрос: каким образом нуклеотидная последо­вательность и-РНК переводится в аминокислотную последовательность бел­ка? Было высказанопредположение, что это возможно с помощью генети­ческого кода. В качестве генетического кода могут выступать сочетания из четырех азотистых оснований. Заранее можно было предположить, что генетический код не может состоятьиз одного или двух азотистых основании, так как в этом случае сочетаний может быть 16, а аминокислот 20. По мнению Г. Гамова генетический код должен состоять из трех азотистых ос­нований. В этом случае получается 64 сочетания, что вполне достаточно для кодирования всех аминокислот.

Расшифровку генетического кода начали Ниренберг и Маттеи в 1961 году. Они получили синтетические полимеры типа т-РНК. Искусственный полимер содержал только один нукдеотид - урацил. Этот полимер был вве­ден в бесклеточную среду из кишечной палочки, которая содержала все аминокислоты, рибосомы, АТФ и ферменты. В результате получили полипеп­тид, состоящий только из фенилаланина. В другом опыте использовали ис­кусственно полученный полинуклеотид, состоящий только из цитозинов, получили полипептид, который включал аминокислоту пролин. Затем были получены молекулы РНК разного состава и выяснено какие аминокислоты они шифруют. К 1966 году были определены все триплеты, кодирующие ту или иную кислоту. Генетический код был пол­ностью расшифрован. Было выяснено, что 61 триплет кодирует аминокисло­ты, а три триплета, являются терминальными или определяют конец синтеза конкретной белковой молекулы. Таблица генетического кода приводиться ниже:

 

Таблица генетического кода

 

1-й нуклеот.	2-й нуклеотид	3-й нуклеот.
У	Ц	А	Г
У	ФЕН ФЕН ЛЕЙ ЛЕЙ	СЕР СЕР СЕР СЕР	ТИР ТИР термин. термин.	ЦИС ЦИС термин. ТРИ	У Ц А Г
Ц	ЛЕЙ ЛЕЙ ЛЕЙ ЛЕЙ	ПРО ПРО ПРО ПРО	ГИС ГИС ГЛН ГЛН	АРГ АРГ АРГ АРГ	У Ц А Г
А	ИЛЕ ИЛЕ ИЛЕ МЕТ	ТРЕ ТРЕ ТРЕ ТРЕ	АСН АСН ЛИЗ ЛИЗ	СЕР СЕР АРГ АРГ	У Ц А Г
Г	ВАЛ ВАЛ ВАЛ ВАЛ	АЛА АЛА АЛА АЛА	АСП АСП ГЛУ ГЛУ	ГЛИ ГЛИ ГЛИ ГЛИ	У Ц А Г

 

Таким образом, окончательно установлено, что генетический код является триплетным. Кроме того, к свойствам генетического кода отно­сят: вырожденность, неперекрываемость и универсальность. Вырожден­ность генетического кода заключается в том, что, как правило, одну аминокислоту кодируют не один, а несколько триплетов. В генетическом коде есть аминокислоты, кодируемые одним, двумя, тремя, четырьмя и шестью триплетами. Неперекрываемость генетического кода связана с тем, что каждый из нуклеотидов входит только в один из кодонов и считывание идет в одном направлении - триплет за триплетом. Генетический код уни­версален. Это значит, что у животных, растений, бактерий и вирусов од­ну и ту же аминокислоту кодируют одинаковые сочетания.

Процесс реализации наследственной информации в биосинтезе белка осуществляется при участии трех видов РНК, ферментов, АТФ и других компонентов. Передачу наследственной информации с ДНК на белок можно представить следующим образом: ДНК → и-РНК → белок. Процесс биосинте­за сложный и включает ряд этапов - транскрипцию, сплайсинг и трансля­цию.

Первый этап называется транскрипцией.Он происходит в ядре клетки. В результате транскрипции наследственная информация с ДНК переписыва­ется на и-РНК. Этот процесс осуществляется при участии ряда ферментов, главным из которых является РНК-полимераза. Исследования показали, что в результате транскрипции синтезируется проматричная РНК, которая зна­чительно больше по размеру и содержит фрагменты не несущие наследс­твенной информации. Они получили название интронов в отличие от коди­рующих фрагментов, которые называются экзонами. Интроны считываются с молекулы ДНК одновременно с экзонами, поэтому про-м-РНК значительно длиннее, чем зрелая м-РНК. В дальнейшем интроны "вырезаются" из моле­кулы РНК, а фрагменты экзонов "сращиваются" между собой в строгом по­рядке. Этот процесс называется сплайсингом. В процессе сплайсинга об­разуется зрелая м-РНК, которая содержит только ту информацию, которая необходима для синтеза белков.

Следующий этап биосинтеза - трансляция.Этот процесс происходит на рибосомах при участии т-РНК. Молекула и-РНК после сплайсинга через по­ры ядра выходит в цитоплазму и прикрепляется к рибосоме. Трансляция начинается с так называемого стартового кодона - АУТ. Активированные аминокислоты прикрепляются к т-РНК и переносятся к рибосомам. Здесь они в соответствии с генетическим кодом соединяются в полипептидную цепь. Молекула и-РНК обычно работает на нескольких рибосомах (5-20), соединенных в полисомы. Начало синтеза полипептидной цепи называется инициацией. Последовательность аминокислот в молекуле белка определя­ется последовательностью кодонов в и-РНК. Синтез полипептидной цепи прекращается, когда, на и-РНК появляется один из кодонов -терминаторов (УАА, УАГ или УГА). В схематическом виде процесс биосинтеза белка мож­но представить в следующем виде:

 

АГЦ ГТГ ААЦ ТТТ ЦТЦ ЦАА ГГА АГГ

ДНК I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

↓ ТЦГ ЦАЦ ТТГ ААА ГАГ ГТТ ААТ ТЦЦ - смысловая цепь

и- РНК АГЦГУГААЦУУУЦУЦЦААУУААГГ

белок сер - вал – аcн – фен – лей - глн – лей - арг

 

Современное представление о гене.В представлении Г. Менделя единицей наследственности был фактор, контролирующийпроявление в доминантном или рецессивном состоянии од­ного признака. В дальнейшем понятия о гене были развиты в работах Т.Моргана, который показал, что ген это локус (участок) хромосомы, имеющий линейную последовательность и занимающий строго определенное положение.

В соответствии с представлениями классической генетики долгое вре­мя считалось, что ген способен к саморепродукции и является неделимой единицей функции, рекомбинации и мутирования. Вопрос о пересмотре представлений о гене как неделимой единице был поставлен отечественны­ми учеными под руководством Н.П.Дубинина. Изучая мутацию scute (скьют), ими было установлено явление ступенчатого аллеломорфизма. В этом гене было обнаружено 14 мутаций, которые приводили к редукции щетинок на разных участках тела дрозофилы. Изучение разных мутантных аллелей гена scute позволило авторам сделать вывод о том, что ген не является неделимой частью хромосомы, а имеет сложную структуру - он состоит из участков или центров. Согласно центровой теории строения гена ген дро­бим и состоит из отдельных участков или центров, которые могут незави­симо изменяться при мутациях. Мутации могут затрагивать и несколько центров одновременно.

ИсследованиямиБензера установлена и наименьшая единица рекомбина­ции. Было показано, что даже соседние нуклеотиды в молекуле ДНК могут разъединяться путем кроссинговера.

В современном понимании ген - это функциональная единица молекулы ДНК, контролирующая последовательность аминокислот в кодируемом белке.Специфичность гена определяется числом нуклеотидов и их последователь­ностью. Ген имеет определенную величину, выраженную числом нуклеотидов и молекулярной массой. Размер генов у разных организмов различен, од­нако в среднем ген включает около 1000 нуклеотидов. Молекулярная масса гена составляет в среднем 700 тыс. Д. Самыми короткими являются гены, кодирующие т-РНК. Они включают приблизительно 190 пар нуклеотидов. Но имеются и очень длинные гены; например, ген фиброина шелка у тутового шелкопряда включает 16 тыс. пар нуклеотидов.

Ген, кодирующий синтез полипептидной цепи, называется структурным. Кроме структурных генов существуют акцепторные гены, которые осущест­вляют регуляторные функции. Эти гены обладают высокой специфичностью к ним могут присоединяться только определенные молекулы белков-фермен­тов. Доля структурных и акцепторных генов в общей ДНК в геномах разных организмов колеблется от 15 до 98%. Остальная часть ДНК генома получи­ла название избыточной ДНК. Особенно много избыточной ДНК содержится в геномах растений. Для избыточной ДНК характерно наличие повторов одинаковых последовательностей нуклеотидов. Бриттен и Кон установили, что у мыши 70% ДНК составляют уникальные последовательности нуклеоти­дов, а 30% повторы; у человека 68% уникальные последовательности, а 32% повторы. Особенно многократно в молекуле ДНК встречаются повторы структурных генов, кодирующих синтез рибосомальной РНК.

 

Лекция 7