ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

Термин «биотехнология» прочно вошёл в современный лексикон биологов. Этим термином определяют технологию получения разнообразных продуктов и веществ с помощью живых клеток различного происхождения. При этом есть одно существенное отличие биотехнологии от традиционной микробиологической промышленности: она возникла на основе использования микроорганизмов и биосистем с запрограммированными свойствами на основе достижений генной инженерии и инженерной энзимологии. Биотехнология базируется на успехах микробиологи, биохимии, молекулярной биологи и генетики.

Интерес к будущему биотехнологии и её перспективам огромен. Прежде всего, эта отрасль перспективна с экономической точки зрения. Имеется возможность создания безотходных производств с малой энергоёмкостью. Кроме того, в биотехнологии возможно использование возобновляемого сырья или сырья с низким содержанием технологически необходимых компонентов. Перспективность внедрения биотехнологических процессов в производстве обусловлена их компактностью, высоким уровнем механизации и высокой производительностью труда. Эти процессы легко поддаются контролю и регулированию, что позволяет применять автоматизацию.

Поэтому специалисты по научно-техническим прогнозам и эксперты относят биотехнологию, наряду с робототехникой, информатикой и освоением мирового океана, к числу важнейших направлений развития промышленной технологии третьего тысячелетия нашей эры.

Уже и сейчас биотехнология существенно воздействует на нашу жизнь. Множество дорогостоящих медицинских и биологически активных препаратов получают с помощью биотехнологических приёмов. Применение методов генной инженерии используют при получении антибиотиков, инсулина, интерферонов. Биотехнологическим путём производят огромное количество кормового белка и аминокислот. Используют достижения этой отрасли в медицине, сельском хозяйстве, микробиологической промышленности, других областях.

Генетическая инженерия и область её применения.За последние два десятилетия были разработаны новые методы манипулирования с нуклеиновыми кислотами вне организмов. Эти открытия дали толчок бурому развитию молекулярной биологии и генетики – в частности, генетической инженерии.

Термин «генетическая инженерия» появился в научной литературе в 1970 году. Генетическая инженерия как самостоятельная дисциплина возникла в 1972 году, когда учёные Джексон, Симонс и Берг из Стэндфордского университета (США) опубликовали работу о создании искусственным путём первой рекомбинантной (гибридной) молекулы ДНК, из фрагментов взятых у вируса ОВ-40, бактериофага лямбда и бактерии под названием кишечная палочка. Чтобы искусственным путём наделить какой-либо организм новыми свойствами, нужно ввести в него новый ген или группу генов, которые бы там работали – синтезировали белки.

Нужный ген можно получить несколькими способами: непосредственным выделением из клеток, путём химического или химико-форментативного синтеза и копированием соответствующей гену и-РНК для получения комплементарной ДНК (гена).

Первый метод широко использовался на раннем этапе развития генной инженерии. Нужный ген выделяли из молекулы ДНК с помощью специальных ферментов: рестриктаз и лигаз. Рестриктазы представляют собой своеобразные молекулярные ножницы, а лигазы, напротив, способны соединять в единое целое разрезанные молекулы ДНК. Рестриктазы, действуя на двухцепочную молекулу ДНК, «узнают» в ней определённую последовательность нуклеидов. Например, рестриктаза под названием Хинд 2 узнает последовательность из шести нуклеидов ГТЦГАЦ, которую разрезает точно посередине. Рестректаза Р 1 узнает друге шесть нуклеидов ГААТТЦ и режет ДНК ассиметрично, ступенькой:

_____________ Г ААТТЦ ____________

_____________ ЦТТАА Г ____________

В настоящее время известно около 400 рестриктаз, причём каждая из них разрезает молекулу ДНК в строго определённом месте. С помощью ферментов можно удлинять концы ДНК (получать «липкие» концы), удалять её отдельные участки, разрезать точно в том месте, где мы хотим. Следует отметить, что метод непосредственного выделения генов из клеток с помощью ферментов не утратил своего значения и применяется в генетической инженерии и сейчас.

Искусственный синтез гена химическим путём впервые был осуществлён в 1969 году в лаборатории Г. Кораны. Им был синтезирован ген аланиновой т-РНК дрожжей, структура которого к тому времени была полностью расшифрована. Этот ген длиной 77 нуклеотидных пар ( н.п.) не содержал регуляторных последовательностей (промотора) и поэтому не обладал функциональной активностью. Позднее эта же группа авторов синтезировала первый функционально активный ген – ген супрессорой тирозиновой т-РНК кишечной палочки длиной около 200 н.п. В 1977 году К. Итакура и Г. Бойер с сотрудниками синтезировали химическим путём ген, кодирующий гормон млекопитающих – соматостатин. Ген соматостатина был получен на основе сведений о первичном строении этого пептидного гормона, состоящего всего из 14 аминокислот.

В практике генной инженерии широко распространен и третий метод искусственного получения генов, основанный на их ферментативном синтезе с помощью открытых ферментов обратной транскрипции. Эти ферменты способны строить ДНК-копии на разных РНК, включая синтетические полирибонуклеиды. С помощью обратной транскриптазы, называемой иногда ревертазой, можно синтезировать практически любой индивидуальный ген в присутствии и-РНК, методы, выделения которой достаточно разработаны. Этим методом получены и клонированы гены, кодирующие глобины человека, животных и птиц, белок куриных яиц, фибрин шёлка, интерферон и другие белки.

Следует отметить, что полученные одним из указанных выше способов и перенесённые в клетки гены не способны ни самостоятельно воспроизводить себя, ни передаваться потомкам клеток – для этого их нужно предварительно включить в состав генетических структур, обладающих собственным аппаратом воспроизведения. Такие структуры в генетической инженерии называются векторами, или переносчиками. В качестве вектора чаще всего используют бактериальные плазмиды, бактериофаги (вирусы бактерий) и вирусы животных.

Плазмиды широко распространены среди бактерий. Это небольшие кольцевые молекулы, которых в бактериальной клетке бывает от одной до нескольких штук. Плазмиды содержат гены, необходимые для воспроизведения ДНК, и гены устойчивости к антибиотикам (например, к ампицилину и тетрациклину). Внутри этих генов находятся участки действия рестриктаз. Такие участки есть и в других местах плазмид, но те, что внутри генов устойчивости, особенно важны, так как именно туда встраивается чужеродная ДНК. При этом ген повреждается и бактерия, содержащая в себе такую гибридную молекулу, оказывается неспособной противостоять действию антибиотика. Эта особенность и позволяет отобрать для дальнейшего размножения только те бактерии, которые содержат гибридную молекулу ДНК. Практически все плазмидные векторы, используемые в генной инженерии, созданы искусственным путём объединения частей различных природных плазмид. Обычный размер плазмид – 3 -10- тысяч н. п. некоторые плазмиды обладают ещё одой очень важной особенностью: если на клетки, в которых присутствует такой вектор, подействовать антибиотиком хлорамфениколом, то число копий плазмиды в них возрастает от нескольких штук до 1 – 3 тысяч. При этом увеличивается доза нужного гена. Что позволяет получать вставленный в плазмиду ген (или продукт этого гена) в больших количествах. В плазмиду можно вставлять фрагменты чужеродной ДНК размером не более 10-15 тыс. н. п.

Если необходимо получить рекомбинантную молекулу с большим размером вставки (20 и более тыс. н.п.), тогда в качестве вектора используют ДНК бактериофага лямбда. Плазмиды и бактериофаги – наиболее часто используемые векторы. Но существуют и другие типы векторов – космиды, полученные путём объединения небольших фрагментов бактериофага лямбда и плазмид. Они содержат гены, позволяющие им размножаться в бактерии, ген устойчивости к антибиотику тетрациклину и особый участок из бактериофага лямбда под названием кос, который содержит гены, контролирующие упаковку рекомбинантной ДНК в белковую оболочку фага. Космиды позволяют получать гибридные молекулы с длинной вставкой в 35-40 тысяч нуклеотидных пар оснований.

С помощью космид и других вышеперечисленных факторов чужеродные гены вводят в бактериальные клетки. Для клеток животных и человека они не пригодны. Дело в том, что молекулярные механизмы реализации генетической информации у прокариот и эукариот различны и бактериальная плазмида не способна размножаться в животной клетке.

В качестве векторов для переноса генов в клетки животных и человека используют различные вирусы. Так, вектор на основе вируса ОВ-40 увеличивает количество введённой чужеродной ДНК до 100 тыс. нуклеотидных пар. Созданы системы векторов и на основе других вирусов животных, включая вирусы полеомы, осповакцины, герпеса и других. Для переноса генов в растения перспективны векторы, сконструированные на основе плазмид, присутствующих в клетках агробактерий.

В процессе работ было обнаружено, что во многих случаях гены, встроенные в чужеродный организм, не работают. Чтобы достичь высокого уровня экспрессии гена, чужеродную ДНК нужно встроить вблизи от активного промотора транскрипции. В плазмидах таких промоторов практически нет. Для этих целей обычно используют промоторы фаговых или хромосомных генов, которые включают в плазмидные векторы. Типичным примером такого рода служит промотор Р бактериофага лямбда. ДНК с таким промотором активно транскрибируется и образует большое количество м-РНК.

Однако добиться экспрессии в бактериальных клетках генов некоторых белков животных или их вирусов совсем непросто, даже если эти гены сопряжены с сильным промотором. Причины такой неэффективности экспрессии сегодня не совсем ясны.

При всём разнообразии методов основная схема любой генно-инженерной работы остаётся неизменной. Она включает: обработку векторной ДНК и ДНК вводимых наследственных структур рестриктазой с образованием линейных последовательностей с «липкими» концами, образование гибридных молекул ДНК, включение гибридных ДНК в клетку реципиентов, отбор клонов, трансформированных клеток, получение продукта.

Одним из первых продуктов полученных методом генной инженерии, был инсулин. Это гормон, регулирующий обмен сахара в организме человека и животных. Недостаток инсулина приводит к заболеванию сахарным диабетом. Сегодня в мире 1 – 2% населения страдают диабетом и приблизительно 20% этих больных не могут существовать без инъекций инсулина. Для лечения больных сахарным диабетом используют гормон, выделенный из поджелудочной железы животных (коров или свиней). Однако инсулин, как коров, так и свиней несколько отличается по аминокислотной последовательности от инсулина человека и при его использовании вызывает у некоторых больных иммуногенную реактивность. Перспективен в лечении сахарного диабета человеческий инсулин, выделенный из донорской крови. Однако получаемые количества его очень незначительны и не могут удовлетворить спрос на него.

Поэтому фармацевтические фирмы сразу же обратили внимание на генно-инженерный способ производства инсулина. Его разработки начались сравнительно недавно и развивались быстрыми темпами. В 1978 году в США появились сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный инсулин. В этом же году сотрудниками американской фирмы было объявлено об окончании работ по синтезу А и В цепей человеческого инсулина.

В марте 1982 года японская компания «Сионоги» провела клинические испытания синтезированного инсулина человека. Каких-либо побочных эффектов препарата выявлено не было. Таким образом, инсулин является первым продуктом бактерий, полученным генно-инженерным методом и поступившим в продажу для использования во врачебной практике. В нашей стране также освоено производство инсулина биотехнологическим способом.

Не менее перспективным является синтез гормонов, вырабатываемых гипоталамусом (гормона роста соматотропина и его антагониста соматостатина). Соматотропин применяется при лечении карликовости, ожогов, костных переломов, а соматостатин регулирует рост, участвует в регуляции синтеза инсулина, глюкакона. В животноводстве он может применятся для увеличения надоев молока. Эти гормоны также были получены биотехнологическим способом.

Химическим путём были синтезированы гены, отвечающие за выработку соматостатина, которые были вставлены в плазмиду кишечной палочки. Из 1 литра растущей культуры этих бактерий можно получать столько гормона, сколько получают при переработке мозга несколько сотен тысяч овец.

В настоящее время с помощью биотехнологических методов осуществлено производство интерферона (защитного белка), иммуноглобулина и других белков. В реализации программы «Биотехнология» в нашей стране участвует целый ряд научных учреждений.

Соматическая гибридизация. Получение моноклональных антител.

Методы гибридизации, основанные на индуцированном слиянии соматических клеток, уже довольно давно и успешно применяются в биотехнологии.

Ещё в 1960 году французский учёный Барский впервые обнаружил, что соматические клетки животных способны сливаться и объединять генетическую информацию двух родительских форм. Он установил, что при совместном культивировании двух линий опухолевых клеток мыши образуется новый тип клеток, которые по морфологическим и биохимическим признакам промежуточны между исходными линиями и содержат хромосомы обеих линий. Однако такое слияние клеток в обычных условиях бывает редко. Поэтому в дальнейшем была разработана техника гибридизации с помощью инактивированного вируса типа Сендай. Было замечено, что этот вирус обладает способностью «склеивать» клетки между собой. Обычно вирус убивают ультрафиолетовыми лучами или мутагеном, а затем вносят в смешанную культуру двух типов клеток. Некоторые клетки при этом склеиваются в одну клетку с двумя ядрами. После митотического деления из двуядерной формируются две одноядерные клетки, содержащие по одному набору хромосом каждого типа родительских клеток.

При помощи этого вируса удалось получить гибриды клеток разных видов, которые обычным половым путём никогда не могут быть получены: например, межвидовые гибридные клетки человека и мыши, цыплёнка и человека, норки и коровы и многие другие. Оказалось возможным гибридизировать также клетки из разных тканей – например, лимфоциты и фибробласты, нормальные и опухолевые клетки.

Соматические гибриды открыли новые возможности для изучения механизмов, контролирующих активность генов, размножение клеток и их дифференцировку, а также изучения механизма взаимодействия ядра и цитоплазмы. Стало возможным картировать гены в хромосомах человека. Дело в том, что гибридные клетки, хотя и могут длительное время размножаться, испытывают межвидовую несовместимость. Со временем в культуре клеток образуются клоны, совсем или почти совсем утратившие хромосомы другого вида. Например, установлено, что гибридные клетки человека и мыши через 100 последовательных клеточных делений полностью утрачивают хромосомы человека. Поэтому в популяции клеток можно найти клоны, в которых сохранилась только одна хромосома человека. По наличию или отсутствию в таких клетках определённых веществ можно судить, имеется ли в данной хромосоме определённый ген. Если при утере хромосомы клетка прекращает вырабатывать какой-либо фермент, то очевидно, что ген, кодирующий этот фермент, находится именно в данной хромосоме. Таким путём была определена локализация многих генов в хромосомах человека.

Метод гибридизации соматических клеток животных и человека нашёл исключительно важное практическое применение. На его основе разработана гибридомная технология получения антител.

Известно, что антитела, образуемые в ответ на введение антигенов (бактерий, вирусов и др.), представляют собой белки-иммуноглобулины, которые и защищают от различных болезней. Но любое чужеродное тело, поступающее в организм, представляет собой смесь различных антигенов, которые будут возбуждать выработку различных антител. Например, эритроциты человека обладают антигенами не только для группы крови АВО, но и многими другими. Поэтому в сыворотке крови иммунизированных животных находится смесь антител, которые продуцируются разными лимфоидными клетками. А для практических целей необходимы антитела одного типа, т.е. моноспецифичные сыворотки с одним типом антител. Очистка и выделение отдельных антител – дело сложное и трудоёмкое.

В 1975 году учёными Келлером и Мильштейном был разработан способ получения гибридов лимфоцитов мыши, иммунизированных предварительно каким-либо антигеном, и культивируемых клеток костного мозга (миеломных клеток). Для эксперимента был взят штамм миеломных клеток, которые неспособны, синтезировать один из ферментов. Эти клетки погибали на селективной среде без добавки ГАТ (гипоксантина, аминоптерина, тимидина). Лимфоциты же в этой среде жили нормально. Миеломные клетки вместе с лимфоцитами поместили на такую среду, добавили туда полиэтиленгликоль (ПЭГ) – это вещество, как и вирус Сендай, способствует слиянию клеток. Слившиеся клетки приобрели от лимфоцитов способность синтезировать определённое антитело и выживать на среде с ГАТ. От раковых клеток они приобрели способность бесконечно размножаться в лабораторных условиях.

Полученные гибридные клетки были названы гибридомами. Так были созданы соматические гибриды, способные синтезировать моноклональные антитела в неограниченном количестве.

Антитела, выработанные одним клоном, по всем параметрам одинаковы, они взаимодействуют только с одним антигеном. Следовательно, полученная гибридома может служить идеальным по специфичности реагентом на ту или иную органическую субстанцию, а также диагностическим или лечебным средством. Моноклональные антитела сейчас применяются в самых разнообразных областях медицины и биологии: как в фундаментальных исследованиях, так и для получения биологически активных веществ высокой чистоты как диагностические агенты – например, для определения групп крови. Они оказались перспективными и для лечения некоторых болезней – в частности, злокачественных опухолей.

Английским учёным удалось получить антитела, специфически «узнающие» злокачественные опухоли толстой и прямой кишок. Больные, подвергнутые клиническому обследованию по подозрению на такие опухоли, получали инъекцию моноклональных антител, меченных радиоактивным изотопом. На рентгенограммах с исключительной точностью определялись истинные размеры опухоли и её распространение на другие органы. Так впервые опухоль и её метастазы локализованы специфическими антителами. Открытия английских учёных получили подтверждение при диагностике с помощью моноклональных антител опухоли щитовидной железы и желудочно-кишечного тракта.

Биотехнология в животноводстве. Получение трансгенных животных. Успехи, достигнутые в выделении генов высших организмов, их рекомбинирование с бактериальными плазмидами, интеграция рекомбинантной ДНК в животную клетку и экспрессия чужеродных генов позволяют создавать животных с нужным генотипом. Весьма перспективная задача введения в геном животных генов, отвечающих за синтез определённых веществ (гормонов, ферментов, антител, и др.). В последние годы разработаны надёжные методы введения в организм животного чужеродных генов. В основе этих методов лежит введение в зиготу или ранний эмбрион клонированных эукариотических генов в составе бактериальных плазмид. Животных, в геном которых интегрируют чужеродные гены, называют трансгенными.

Первые опыты по получению трансгенных животных были выполнены на мышах, так как они наиболее изучены в генетическом отношении. На мышах наиболее полно разработаны микрохирургия зигот и ранних эмбрионов, методы культивирования ооцитов и зародышей вне организма. Установлено, что инъекция чужеродной ДНК в зиготу или мужской пронуклеус приводит к включению её в геном животного, и сегодня уже осуществлён перенос в геном мыши ряда различных эукариотических генов.

Особый интерес вызывает опыт, в котором впервые удалось успешно интегрировать в геном мыши ген гормона роста крысы. Для микроинъекции была использована рекомбинантная ДНК, состоящая из сшитых фрагментов различных генов.

Исследователи инъецировали в зиготы мыши около 600 копий такой рекомбинантной ДНК. Всего был получен 21 потомок мышей. У семи мышей был обнаружен чужеродный ген гормона роста крысы, который был интегрирован в хромосомы. Анализ крови трансгенных мышей показал, что концентрация гормона роста у них в 100-800 раз больше нормы, что способствовало их интенсивному росту. Живая масса трансгенных мышат была в 1,8 раза больше контрольных – их называли супермышами.

Успешные опыты по получению трансгенных мышей способствовали проведению подобных работ и с другими видами млекопитающих – кроликами, овцами, свиньями и крупным рогатым скотом. Из этих опытов наиболее успешным был перенос в зиготу гена гормона роста овец. Такие эксперименты провели австралийские учёные, создавшие впервые в мире трансгенных овец. Через 5 недель после рождения трансгенным овцам ввели небольшую дозу цинка, который активировал промотор этого гена. В вязи с более активным синтезом гормона роста трансгенные овцы быстрее росли и по массе в 1,5 раза превышали сверстников. Австралийские учёные предполагают ввести овцам и другие гены, которые должны привести к ускорению роста шерсти, усилению резистентности к болезням.

Особый интерес представляют опыты по получению трансгенных особей у крупного рогатого скота, так как они могут выводить в большом количестве продукты чужеродных генов с молоком.

В перспективе на основе генно-инженерной технологии ожидается разработка получения животных для производства новых продуктов. Речь идёт о введении животным генов белков, которые могут быть произведены в промышленном масштабе или будут полезны с медицинской точки зрения. Например, из коровьего молока трансгенных животных можно будет извлекать такие белки, как инсулин человека, интерферон, факторы свёртывания крови и другие.

Следует отметить, что несмотря на достигнутые успехи в получении трансгенных животных, говорить об их практическом использовании сегодня рано. Ещё предстоит сложная и кропотливая работа по разработке надёжных методов включения в геном донора чужеродных генов, их экспрессии и стабильном наследовании.

Химерные организмы и методы получения генетических мозаиков.В настоящее время одним из перспективных направлений биотехнологии животных является искусственное получение химер, или генетических мозаиков. Сущность этого метода, основанного на достижениях клеточной инженерии и микроманипуляциях на ранних эмбрионах, заключается в искусственном объединении эмбриональных клеток двух и более животных, относящихся не только к одной породе, но и к разным породам и даже видам. Полученные животные-химеры несут признаки разных генотипов. Современная микрохирургия позволяет получать химер, имеющих 4-х и более родителей.

Существует два метода получения химерных животных – агрегационный и инъекционный. Агрегационный метод заключается в объединении клеток генетически разнородных зародышей на ранних стадиях их развития, а инъекционный – в микроинъекции клеток в бластоцисту эмбриона-реципиента.

Первыми созданными и идентифицированными химерами были мыши между двумя линиями, которые различались по окраске (чёрные и белые).Их химерное потомство оказалось крапчатым. Это связано с тем, что организм мышей – химер включал генетически разные популяции клеток, то есть представлял генетических мозаик.

В последние годы большое внимание уделяется получению межпородных и межвидовых химер млекопитающих. Это особенно важно в селекции сельскохозяйственных животных, так как межвидовые и межпородные химеры могут сочетать в одном организме разные хозяйственно-полезные признаки.

Учёными были получены химеры между двумя близкими видами мышей, которые обычно не скрещиваются – М. мускулюс и М. кароли. У межвидовых химер, которые развивались в организме М. кароли не выявили иммуногенетической несовместимости клеток, их развитие происходило нормально. Если же межвидовые химеры получали реципрокной инъекцией, и развитие происходило в организме М. мускулюс, то химеры погибали в течение 16 суток после пересадки. Таким образам, не всегда удаётся получить химерных животных разных видов.

Успехи, достигнутые в разработке методом создания химерных лабораторных млекопитающих, позволили практически подойти к созданию химерных сельскохозяйственных животных. В начале 80-х годов была предпринята попытка получить химерных телят от коров европейского и индийского типов. В результате был получен химерный теленок. Фенотипически он отличался от сверстников, но при эритроцитарном типировании у него обнаружены были антигены, типичные для европейского скота.

Для получения межвидовых химер между овцой и козой применяли агрегационный и инъекционный методы и реципрокные пересадки. В результате опытов было получено 8 химерных животных. Шерсть у них представляла собой смесь волос исходных видов, рога по строению были, как у козы, но закручены, как у барана, а экстерьер соответствовал одному из родительских видов. Таким образом, у химер наблюдали мозаичность только волосяного покрова. Интересным представляется факт рождения ягнёнка от козы и козлёнка от овцы. Эти животные развивались из инъецированных химер.

Следует отметить, что химерные животные не передают потомкам характерную для них генетическую мозаичность. Подобно гетерозиготным или гибридным животным, у их потомков происходит расщепление, в результате чего нарушаются ценные генетические комбинации. Хотя химерные животные поддерживают хозяйственно-полезные признаки лишь на протяжении одного поколения, для разведения крупного рогатого скота они могут представлять большой практический интерес. Например, можно создавать химерных животных, сочетающих такие признаки, как молочная и мясная продуктивность, которые являются антогонистами и несовместимыми в одном организме. Создание инъекционных химер путём введения в эмбрион определённой линии клеток позволит улучшить иммунную систему и повысит резистентность к ряду болезней.

Трансплантация эмбрионов и клонирование в животноводстве.В последнее время в практику племенной работы начали внедрять такой биотехнологический метод, как трансплантация эмбрионов. Этот метод не заменяет искусственного осеменения, а дополняет его.

Большие потенциальные возможности к воспроизводству имеются не только у самцов млекопитающих, в яичниках которых содержатся десятки и даже сотни тысяч ооцитов. Естественным путём лишь единицы из них реализуются в потомстве. В отличие от самцов, препятствием на пути более рационального использования воспроизводственного потенциала самок млекопитающих является необходимость вынашивания ими потомства в эмбриональный период развития. Это препятствие может быть устранено, если самку использовать в роли донора, только не гамет, как самца, а эмбрионов. Для вынашивания потомства можно использовать организм приёмных матерей-реципиентов. Это позволит интенсифицировать воспроизводство отдельных самок за счёт реализации потенциала запасов яйцеклеток в их яичниках.

Теоретически от выдающейся коровы-донора за всю её жизнь можно получить не менее 500 телят. Особенно важно интенсифицировать размножение быковоспризводящих коров, от которых планируется получение самцов для проверки по качеству потомства и дальнейшего отбора от них улучшателей.

У сельскохозяйственных животных ни яйцеклетка, ни эмбрион не поступают во внешнюю среду. Эмбриогенез у них протекает и заканчивается в матке. Поэтому получение эмбрионов или яйцеклеток у млекопитающих всегда сложнее по сравнению с получением у них мужских гамет.

В настоящее время разработаны нехирургические методы извлечения ранних (ещё не прикрепившихся клетками трофобласта к слизистой оболочке матки) эмбрионов у коров. С помощью специально сконструированных катетеров можно физиологически сбалансированными средствами вымывать ранние эмбрионы из половых органов самок. Эффективность вымывания эмбрионов в среднем составляет 60-80%. Сегодня считается

 

 

невыгодным вымывать эмбрионы у самок с одной овуляцией в спонтанном половом цикле. Разработаны способы гормональной стимуляции у них множественной овуляции. Известны случаи, когда за год от одной коровы получали более 100 полноценных эмбрионов.

Важное значение имеет длительное хранение эмбрионов. Самым эффективным и перспективным методом консервации эмбрионов является их глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре - 196°С. Разработка метода долговременного хранения криоконсервированных эмбрионов значительно расширяет возможности трансплантации.

Долговременное хранение глубокозамороженных эмбрионов имеет ряд преимуществ. При этом методе отпадает необходимость в содержании больших стад или групп реципиентов, так как пересадки могут быть проведены в любое время независимо от срока взятия эмбрионов от донора, что существенно повышает рентабельность трансплантации. Кроме того, криоконсервация эмбрионов позволяет создать эмбриобанки от генетически ценных животных, а так же сохранить генофонд редких и исчезающих пород и транспортировать эмбрионы в любые страны мира. При соблюдении правильной биотехнологии выживаемость эмбрионов составляет 90%, а стельность коров-реципиентов после пересадки замороженных эмбрионов наступает в 50-55% случаев.

Теоретические разработки в области трансплантации ранних эмбрионов с успехом применяются на практике за рубежом и в нашей стране. В США ежегодно получают более 100000 телят-трансплантантов. В нашей стране объёмы трансплантации меньше, но этот метод также с успехом используется в селекционных программах.

Перспективным направлением в биотехнологии считают оплодотворение ооцитов сельскохозяйственных животных вне организма с последующим доращиванием и трансплантацией ранних эмбрионов. В нашей стране под руководством Л. К. Эрнста были проведены эксперименты и получены телята в результате трансплантации зародышей, оплодотворённых вне организма. Однако этот метод разработан недостаточно, и говорить о его практическом применении ещё рано.

Успехи, достигнутые в разработке техники культивирования ооцитов и зародышей в сочетании с достижениями в области манипулирования с яйцеклетками и ранними эмбрионами, позволяют применять совершенно новые способы размножения сельскохозяйственных животных. Так, при половом размножении, в результате комбинационной изменчивости, в последующих поколениях обычно теряется выдающийся генотип животных – рекордистов. Современные методы биотехнологии позволяют избежать подобных потерь и полностью сохранить однажды созданный генотип в последующих поколениях. Известно, например, что однояйцовые близнецы, генетические аналоги, происходят от одной зиготы, разделяющейся в раннем эмбриогенезе. Принципиальный механизм этого явления может быть использован для искусственного получения животных – генетических аналогов. Для этого на ранних стадиях развития, когда ещё клетки не дифференцировались, зародыш необходимо разделить на отдельные бластомеры. При этом бластомеры должны сохранять способность к самостоятельному делению и развитию. Часть из них может быть имплантирована коровам-реципиентам, а другая подвергнута длительному хранению в условиях глубокой заморозки. После того, как животные-имплантанты будут выращены и испытаны на продуктивность, можно будет с полным основанием использовать хранящиеся в замороженном виде эмбрионы.

Практически возможность разделения ранних эмбрионов сельскохозяйственных животных была успешно продемонстрирована на овцах в 1979 году. В эксперименте были использованы двухклеточные эмбрионы, после разделения, которых на отдельные бластомеры и последующей пересадки подготовленным реципиентам было получено пять монозиготных близнецов.

В дальнейшем у крупного рогато скота, с помощью микрохирургических методов было осуществлено разделение зародышей на стадии морулы (бластоцисты) на половинки или четвертушки и при трансплантации их получены полноценные телята. Эти опыты имеют значение не только в прикладном, но и в теоретическом плане. До недавнего времени считалось, что манипуляции с зародышевым диском недоступны, так как могут привести к неполноценности полученного потомства. В опытах была показана возможность полного восстановления уже дифференцированного, разделённого пополам зародышевого диска.

Возникает вопрос: на сколько частей можно разделить эмбрион для получения микроклона, то есть одинаковых по генотипу потомков? По-видимому, при обеспечении оптимальных условий для культивирования ранних эмбрионов вполне реально выращивание половинок до целых эмбрионов, которые затем можно будет также разделять. Это позволит получать большое количество пригодных для трансплантации эмбрионов.

Первые эксперименты не только подтвердили возможность получения двоен за счёт разделения эмбрионов, но и показали реальный путь повышения эффективности их использования при трансплантации. Этот способ получения потомства уже применяется при трансплантации.

К недостаткам получения потомства методом клонирования зародышей следует отнести то обстоятельство, что происходит копирование генотипа, ещё неизвестного в отношении продуктивных качеств.

Большой интерес представляет техника копирования животных с уже известной продуктивностью. Для этого могут быть использованы другие биотехнологические подходы к размножению животных. В частности, техника пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки, разработанная Бригсом, Кингом и Гердоном, может служить основой для разработки подобных методов у сельскохозяйственных животных. При этом яйцеклетку с пересаженным ядром можно размножать в лаборатории тем же способом, что и отдельные бластомеры, затем заморозить размноженные клетки и пересаживать их ядра в трансплантируемые зародыши. Перспективность этого направления состоит в том, что отпадает необходимость проверки потомков по полу, продуктивности и другим качествам. Если ядро брать из соматической клетки коровы-рекордистки, то все потомки будут тёлочками с таким же генетическим потенциалом, что и у матери.

Перспективным биотехнологическим приёмом можно считать и партеногенетическое размножение животных. Сегодня наибольшие успехи в этом направлении достигнуты в шелководстве. Однако явление партеногенеза экспериментально удалось получить и у сельскохозяйственных животных.

 

Лекция № 8