Разрешающая способность микроскопа

Технически возможно создать оптические микроскопы, объективы и окуляры которых дадут общее увеличение 1500-2000 и больше. Однако это нецелесообразно, так как возможность различить мелкие детали предмета ограничивается дифракционными явлениями. Вследствие этого изображение мельчайших деталей предмета теряет резкость, может возникнуть нарушение геометрического подобия изображения и предмета, соседние точки будут сливаться в одну, возможно полное исчезновение изображения. Поэтому в оптике существуют следующие понятия, которые характеризуют качество микроскопа:

Разрешающая способность микроскопа - свойство микроскопа давать раздельно изображение мелких деталей рассматриваемого предмета.

Предел разрешения - это наименьшее расстояние между двумя точками, которые видны в микроскопе раздельно.

Чем меньше предел разрешения, тем выше разрешающая способность микроскопа!

Предел разрешения обусловливает наименьший размер деталей, которые могут различаться в препарате с помощью микроскопа.

Теорию разрешающей способности микроскопа разработал директор завода К.Цейса в Йене профессор-оптик Э.Аббе (1840-1905). В качестве простейшего микропрепарата он взял дифракционную решетку ( рис. 2), изучил механизм формирования изображения в микроскопе и показал следующее.

1. Пучок вторичных световых волн после дифракции на объекте DD попадает в объектив и создает в результате интерференции в его фокальной плоскости FF дифракционную картину - систему главных максимумов и минимумов.

Рис. 2

2. Далее в формировании изображения участвуют только лучи, образующие главные максимумы. Они пересекаются в соответствующей плоскости и дают изображение объекта D^’D^’.

Введем понятие апертурного угла - это угол между крайними лучами конического светового пучка, идущего от середины объекта в объектив ( рис. 3,а). Для создания изображения, то есть для разрешения объекта, достаточно, чтобы в объектив попали лучи, образующие максимумы только нулевого и первого порядка хотя бы с одной стороны ( рис. 2 и 3,б). Участие в образовании изображения лучей от большего количества максимумов повышает качество изображения, его контраст. Поэтому лучи, образующие эти максимумы, должны быть в пределах апертурного угла объектива.

а) б) в) г)

1- фронтальная линза объектива, 2 - объектив

Рис .3

Таким образом, если объектом является дифракционная решетка с периодом d и свет падает на нее нормально ( рис.2 и 3,б), то в формировании изображения обязательно должны участвовать лучи, образующие максимумы нулевого и первого порядков с обеих сторон, а угол j₁- угол отклонения лучей, образующих максимум первого порядка, соответственно должен быть, в крайнем случае, равен углу U/2.

Если же взять решетку с меньшим периодом d’, то угол j’₁будет больше угла U/2 и изображение не возникнет. Значит период решетки d можно принять за предел разрешения микроскопа Z. Тогда, используя формулу дифракционной решетки, запишем для k=1:

.

Заменяя d на Z, а j₁ на U/2, получим

. (6)

Во время микроскопии световые лучи падают на объект под разными углами. При наклонном падении лучей (рис.3,г) предел разрешения уменьшается, так как в формировании изображения будут участвовать только лучи, образующие максимумы нулевого порядка и первого порядка с одной стороны, а угол j₁ будет равен апертурному углу U. Расчеты показывают, что формула для предела разрешения в этом случае принимает следующий вид:

. (7)

Если пространство между объектом и объективом заполнить иммерсионной средой с показателем преломления n, который больше показателя преломления воздуха, то длина волны света l_n = l ¤ n . Подставляя это выражение в формулу для предела разрешения (7), получим

, или . (8)

Таким образом, формула (7) определяет предел разрешения для микроскопа с сухим объективом, а формула (8) -для микроскопа с иммерсионным объективом. Величины sin 0,5U и n×sin 0,5U в этих формулах называют числовой апертурой объектива и обозначают буквой А. Учитывая это, формулу предела разрешения микроскопа в общем виде записывают так :

. ( 9)

Как видно из формул (8) и (9), разрешающая способность микроскопа зависит от длины волны света, величины апертурного угла, показателя преломления среды между объективом и объектом, угла падения световых лучей на объект, но она не зависит от параметров окуляра. Окуляр никакой дополнительной информации о структуре объекта не дает, качества изображения не повышает, он лишь увеличивает промежуточное изображение.

Разрешающая способность микроскопа может быть повышена за счет использования иммерсии и уменьшения длины волны света. Повышение разрешающей способности при использовании иммерсии можно пояснить следующим образом. Если между объективом и объектом находится воздух (сухой объектив), то световой луч при переходе из покровного стекла в воздух, среду с меньшим показателем преломления, значительно изменяет свое направление в результате преломления, поэтому меньше лучей попадает в объектив. При использовании иммерсионной среды, показатель преломления которой приблизительно равен показателю преломления стекла, изменение хода лучей в среде не наблюдается и большее количество лучей попадает в объектив.

В качестве иммерсионной жидкости берут воду (n=1,33), кедровое масло (n=1,515) и др. Если максимальный апертурный угол у современных объективов достигает 140⁰ , то для сухого объектива А=0,94, а для объектива с масляной иммерсией А=1,43. Если при расчете использовать длину волны света l = 555 нм, к которой наиболее чувствителен глаз, то предел разрешения сухого объектива составит 0,30 мкм, а с масляной иммерсией - 0,19 мкм. Значение числовой апертуры указывается на оправе объектива: 0,20; 0,40; 0,65 и др.

Повышение разрешающей способности оптического микроскопа за счет уменьшения длины волны света достигается при использовании ультрафиолетового излучения. Для этого имеются специальные ультрафиолетовые микроскопы с кварцевой оптикой и приспособлениями для наблюдения и фотографирования объектов. Так как в этих микроскопах используется свет с длиной волны примерно в два раза меньше, чем у видимого света, то они способны разрешать структуры препарата размерами около 0,1мкм. Ультрафиолетовая микроскопия имеет еще одно преимущество - с ее помощью можно исследовать неокрашенные препараты. Большинство биологических объектов прозрачны в видимом свете, так как не поглощают его. Однако они обладают избирательным поглощением в ультрафиолетовой области и, следовательно, легко различимы в ультрафиолетовых лучах.

Наибольшая разрешающая способность у электронного микроскопа, так как длина волны при движении электрона в 1000 раз меньше длины световой волны.