Межнуклеотидная связь в РНК

Межнуклеотидная связь в РНК. Более сложным оказался вопрос о природе межнуклеотидной связи в РНК. Уже на первых этапах изучения строения РНК был установлен факт чрезвычайной неустойчивости се при щелочном гидролизе.

Основными продуктами щелочного гидролиза РНК являются рибонуклсозид-2 - и рибонуклеозид-З -фосфаты, образующиеся практически в равных количествах. Рибонуклеозид-5 -фосфаты при этом не образуются. Эти данные не укладывались в представления о фосфодиэфирной природе межнуклеотидной связи в РНК и требовали всестороннего изучения. Очень важную роль в таком исследовании, которое выполнили в начале 50-х гг. Тодд с сотрудниками, сыграли синтетические алкиловые эфиры рибонуклеотидов, которые были получены специально, чтобы промоделировать тот или иной тип фосфодиэфирной связи.

Полученные школой Тодда данные о механизмах превращения алкиловых эфиров рибонуклеотидов в щелочной среде позволили предположить, что в РНК, так же как и в ДНК, межнуклеотидная связь осуществляется фосфатной группой и 3 - и 5 -гидроксильными группами углеводных остатков. Подобная связь в РНК должна очень легко расщепляться в щелочной среде, так как соседняя 2 -гидроксильная группа должна катализировать этот процесс при рН 10, когда начинается ионизация гидроксильных групп рибозы.

Очень важно подчеркнуть, что промежуточными соединениями при щелочном расщеплении должны быть все четыре рибонуклеозид-2 ,З -циклофосфата, а конечными - образующиеся при их гидролизе рибонуклеозид-3 -фосфаты и рибонуклеозид-2 -фосфаты четыре пары изомеров. Данные щелочного гидролиза ограничили количество возможных для РНК типов межнуклеотидных связей, но не прояснили вопроса о том, как построен этот полимер.

Более точные сведения о типе межнуклеотидной связи в РНК, как и в случае ДНК, были получены с помощью ферментативного гидролиза. Гидролиз РНК с использованием ФДЭ змеиного яда, протекающий до рибонуклеозид-5 -фосфатов, подтвердил уже прямым путем предположение об участии 5 -гидроксильных групп в образовании фосфодиэфирной связи между мономерными звеньями. Позднее это было окончательно установлено в результате открытия фосфоролиза РНК в присутствии фермента полинуклеотидфосфорилазы ПНФаза, приводящего к образованию рибонуклеозид-5 -пирофосфатов Таким образом, оставалось выяснить природу второй гидроксильной группы, участвующей в образовании межнуклеотидной связи.

Частично решить эту задачу помог еще один фермент, который использовался для направленного расщепления РНК пиримидиловая рибонуклеаза РНаза. Ранее было показано, что этот фермент расщепляет только алкиловые эфиры пиримидиновых рибонуклеозид-3 -фосфатов до рибонук-леозид-3 -фосфатов через промежуточный рибонуклеозид-2 ,З -циклофосфат. Оказалось, что аналогичным образом этот фермент действует и на РНК. В экспериментах с любыми образцами очищенной РНК было обнаружено, что количество фосфорной кислоты, которая образуется при обработке полимера последовательно пиримидиловой РНазой и фосфомоноэстеразой ФМЭ , а также количество иодной кислоты, затрачиваемой на последующее окисление, эквивалентно количеству остатков пиримидинов в данном образце РНК. Это говорило в пользу того, что по крайней мере пиримидиновые нуклеотиды в РНК связаны с соседними нуклеотидами только посредством 3 -5 -межнук-леотидной связи.

Этот вывод подтверждают данные щелочной обработки ферментативных гидролизатов РНК, полученных после действия на нее РНазы в щелочной среде миграция фосфатного остатка в рибонуклеозид-З - и -2 -фосфатах невозможна, и наличие в соответствующих гидролизатах только пиримидиновых рибонуклеозид- З -фосфатов делает очевидным 3 -5 -тип межнуклеотидной связи для пиримидиновых нуклеотидов. 7.