Хроматография на бумаге

Хроматография на бумаге. По механизму разделения различают распределительную, адсорбцион¬ную, осадочную и другие виды бумажной хроматографии (БХ). В распре¬делительной жидкость-жидкостной хроматографии бумага, приготовлен¬ная из специальных сортов хлопка, выполняет роль носителя неподвижной жидкой фазы (НФ), в качестве которой часто выступает вода, адсорбиро¬ванная парами бумаги.

В таком случае гидрофильная бумага используется для нормально-фазовой хроматографии. Растворителями (ПФ) являются спирты (метанол, этанол, н-пропанол, бутанол), простые эфиры (этиловый, метиловый), кетоны (ацетон, ацетил-ацетон), эфиры органических кислот (метилацетат, этилацетат), пиридин, хлороформ.

Чаще используются смеси растворителей.

Так, для разделения неорганических неполярных веществ употребляют системы: - ацетон: НCl: Н2О (в различных соотношениях); - Н-бутанол, насыщенный НСl (различной концентрации); - Н-бутанол: 0,1М НNОз - ацетилацетон. Для разделения некоторых органических веществ используют метод обращенных фаз. В этом методе для придания бумаге гидрофобного харак¬тера ее импрегнируют (пропитывают) нафталином, парафином, раствором каучука, силиконом и др. Такая бумага служит носителем для неполярных растворителей в качестве НФ. В качестве ПФ применяют смеси кислот с низшими спиртами. Обращеннофазовая бумажная хроматография использу¬ется, например, для разделения и идентификации полинасы¬щенных жирных кислот при изучении состава липидов, вы¬деленных из животных тканей.

Бумагу пропитывают 5% рас¬твором силикона, в качестве ПФ используют 85% раствор уксусной кислоты. Рис.3.4.1. Виды бумажной хроматографии Разделение веществ в распределительной БХ осуществляется благодаря различию в скоростях движения компонентов при многократном повторе¬нии актов экстракции и сорбции.

Скорость перемещения компонентов за¬висит от их коэффициентов распределения (как и в методе экстракции). По направлению движения элюента (ПФ) различают восходящую, нис¬ходящую и радиальную (круговую) хроматографию. Если элюент движется по бумаге вверх, метод называют восходящей (а) бумажной хроматографией; при его движении сверху вниз - нисходя¬щей (б) бумажной хроматографией. Очень быстро можно осуществить хроматографический анализ методом радиальной (в) бумажной хромато¬графии, в котором используется бумажный круг (г) с фитилем, опущен¬ным в элюент. (рис. 3.4.1) Иногда при сложном составе пробы не удается разделить ее компонен¬ты с помощью одного растворителя.

Тогда применяют двумерную хрома¬тографию. В угол квадратного листа хроматографической бумаги наносят хроматографической бумаги наносят раствор пробы и хроматографируют сначала в одном элюенте, затем, по¬вернув хроматограмму на 90 в другом.

Первый элюент производит предварительное разделение компо¬нентов пробы, второй окончатель¬ное (рис.3.4.2). Рис.3.4.2. Двухмерная хроматография Для проведения хроматографии на бумаге используют стеклянные герметизированные камеры. Внутри ка¬меры в верхней (нисходящий вариант) или нижней ее части (восходящий вариант) помещают сосуд для подвижной фазы (лодочку). Радиальную хроматографию можно осуществить в чашке Петри. Детекцию зон, идентификацию и количественное определение в БХ проводят также, как и в методе тонкослойной хроматографии.

Методом распределительной жидкостной бумажной хроматографии успешно анализируют смеси катионов в неорганическом качественном анализе, смеси аминокислот и других органических кислот, пептидов, пес¬тицидов, фенолов, красителей, синтетических поверхностно-активных ве¬ществ. 3.5. Гельпроникающая (молекулярно-ситовая) хроматография Гельпроникающая хроматография (ГПХ) представляет собой метод разделения молекул, основанный на различии из размеров.

В качестве НФ в ГПХ используют частицы, имеющие определенные размеры пор. Это различного рода гели (мягкие, полужесткие и жесткие). В качестве ПФ служат водные или органические элюенты. Принцип разде¬ления молекул в ГПХ состоит в том, что молекулы анализируемых ве¬ществ распределены между неподвижным растворителем в порах сорбента и растворителем, протекающим через слой НФ. Молекулы, которые имеют размеры, позволяющие им проникать в поры сорбента при движении вдоль колонки, часть времени теряют на пребывание в порах.

Молекулы, имею¬щие размеры, превышающие размеры пор, не проникают в сорбент и вы¬мываются из колонки со скоростью движения элюента. Молекулы, кото¬рые проникают в поры всех размеров, движутся наиболее медленно. Сни¬жение скорости движения веществ вдоль колонки тем больше, чем в боль¬шее число пор способны диффундировать распределяемые частицы. Таким образом, при помощи ГПХ можно разделить смеси веществ в за¬висимости от размеров их молекул.

Выход веществ из колонки происходит в порядке уменьшения их молекулярной массы. Так можно разделить полипептиды, белки и другие макромолекулы. Гельпроникающая хроматография на колонке используется для очистки пестицидов, а также жирорастворимых витаминов перед их определением методом ВЖХ. Электрофорез Метод анализа, основанный на способности заряженных частиц к пере¬движению во внешнем электрическом поле называют электрофорезом (от “электро” и греческого phoresis — перенесение). Электролиз относится к методам разделения без превращения веществ, на основе заряда частиц. По технике выполнения метод аналогичен хроматографии, поэтому и рассматривается в этой главе.

Рис 3.5.1. Схема прибора для электрофореза. Нередко под электрофорезом понимают перемещение коллоидных час¬тиц или макромолекул, в отличие от иовофореза - перемещения неоргани¬ческих ионов малого размера. Передвижение частиц при электрофорезе зависит от ряда факторов, ос¬новными из которых являются: напряженность электрического поля; вели¬чина электрического заряда; скорость и размер частицы; вязкость, рН и температура среды, а также продолжительность электрофореза.

Электрофорез можно проводить как в свободном растворе (фронталь¬ный электрофорез), так и на носителях (зональный электрофорез). Послед¬ний вариант предпочтительнее, т.к. носители способствуют стабилизации электрофоретических зон. В качестве носителей используют: фильтро¬вальную бумагу, силикагель, крахмал, оксид алюминия, поливинилхлорид, агаровый и полиакриламидный гели и др. Электрофоретическое разделение осуществляют на бумаге, в тонком слое сорбента, колонке или в блоке (который часто формируют из суспен¬зии крахмала в подходящем электролите). Аппаратура для электрофо¬реза выполняется по единой схеме: источник тока, камера для электрофореза, два элек¬трода, соединяющих камеру с источником тока и приспособ¬ление для сбора и идентифика¬ции разделенных веществ (по¬следний блок в некоторых слу¬чаях отсутствует). Для элек¬трофореза используют как готовые наборы аппаратуры (универсальный прибор для иммуноэлектрофореза и электрофореза белков на бумаге и крахмале, набор для электрофоре¬за в полиакриламидном геле венгерской фирмы Реанал), так и наборы, со¬ставляемые экспериментатором из отдельных приборов.

На рис. 3.5.1 представлена схема прибора для электрофореза на бумаге.

Электрофоретическая камера состоит из двух кювет, в которые помещают графитовые электроды и раствор проводящей жидкости (буферный рас¬твор). Выше кювет находится подставка для носителя бумаги. Смесь ве¬ществ, подлежащих разделению, наносят на пропитанную проводящей жидкостью бумагу.

Бумагу подсушивают, помещают на подставку, концы погружают в кюветы, затем камеру плотно закрывают крышкой. После пропитывания бумаги проводящей жидкостью подключают электрический ток. По окончании электрофореза бумагу подсушивают. Качественную и количественную оценку осуществляют, применяя методы, используемые в бумажной хроматографии, например, проявление белков с помощью кра¬сителей, количественную оценку - методом денситометрии.

Важной областью применения электрофореза является анализ белков сыворотки крови, аминокислот гидролизатов белков, нуклеиновых кислот и т.п. В кислотном буферном растворе аминокислота находится в виде катиона NHз+ COOH, который будет перемещаться к катоду, в то время как в щелочном буфере аминокислота превращается в анион NH2 COO и будет дви¬гаться к аноду. В изоэлектрической точке аминокислота находится в растворе в виде биполяр¬ного иона NH3+ COO- и не будет передвигаться в электрическом поле. Рис. 3.5.2. Электрофореграмма (а) и схемы (б) белковых фракций.

A - белковые фракции сыров: 1, 17 – российского, 2, 16 - волжского, 3, 15 – “Орбита”, 4, 14 - колбасного, 5, 13 – голландского, 6, 12 – пошехонского, 7, 11 – “сырного” казеина после осаждения при pH 4,6, 8, 10 – молочной сыворотки, 9 – казеина по Гаммерстену, 18 – “городского”. Б – белковые фракции сыра (I), сырного казеина (II) Ввиду того, что отдельные белки и аминокислоты имеют различные изоэлектрические точки, при определенном значении рН они будут двигаться с различной скоро¬стью. Подбирая соответствующие буферные растворы для установления определенной скорости движения и растворимости веществ, можно ис¬пользовать электрофорез для их разделения. Метод позволяет разделять вещества, различие в изоэлектрической точке которых составляет до 0,02 единиц рН. Градиент рН в 0,02 единицы часто достигают прибавлением амфолитов, представляющих собой готовую смесь алифатических полиаминаполикарбоновых кислот.

Электрофоретическое разделение белков широко используется для оценки качества мяса и мясных продуктов, для дифференцирования вида мяса и рыбы. Метод также применяется для выявления немясных добавок (белков молока, сои, яиц) в мясных продуктах.

С помощью электрофореза в полиакриламидном геле можно охарактеризовать изменение белков в процессе созревания сыров (рис.3.5.2). В настоящее время используют высокоэффективный капиллярный электрофорез, например, для анализа витаминов в диетических продуктах (жирорастворимых А, Е, К, Д; водорастворимых - B1, B2, B6, B12, С, никотинамида); и для определения анионов (сульфат - хлорид иодид-) в мо¬лочных продуктах. 3.6.