Принцип методу.Амілаза відноситься до класу гідролаз – ферментів, що каталізують розрив хімічних зв’язків з приєднанням молекули води. Амілаза слини каталізує гідроліз крохмалю (розрив глікозидних зв’язків) через стадію утворення декстринів до дисахариду мальтози. Це можна підтвердити реакцією з йодом (позитивна для полісахаридів та декстринів) та реакцією Тромера (позитивна для цукрів, що мають вільний півацетальний гідроксил, зокрема для мальтози). Крохмаль реагує з йодом з появою синього забарвлення і не дає забарвлення в реакції Тромера, оскільки не містить вільних альдегідних груп, декстрини реагують з йодом з появою сполук червоного кольору. Мальтоза містить вільну альдегідну групу, а тому її можна виявити за допомогою проби Тромера.
Матеріальне забезпечення:0,5 % розчин крохмалю, 0,1 % І2 в КІ, 10 % розчин NaOH, 5 % розчин CuSO4, дистильована вода, газовий пальник, пробірки, піпетки, штатив.
Хід роботи.Для одержання розведеної слини ротову порожнину злегка прополіскують водою, набирають нову порцію дистильованої води і прополіскують нею рот протягом 1-2 хв. Зібрану в пробірку рідину використовують для аналізу.
Щоб переконатись у тому, що крохмаль з йодом дає синє забарвлення, в пробірку вносять 10 крапель розчину крохмалю та додають 2 краплі розчину I2 в KI. Спостерігають позитивну реакцію.
У штатив ставлять 10 пробірок і наливають у кожну по 2 мл дистильованої води та додають по одній краплі розчину І2 в KI.
В окремій пробірці готують реакційну суміш: наливають 5 мл 0,5 % розчину крохмалю (субстрат), додають 1 мл розведеної слини (джерело амілази), вміст пробірки перемішують і спостерігають опалесценцію. З цієї пробірки кожних 60 секунд відбирають по 0,5 мл рідини і вносять по черзі в пробірки № 1, 2, 3 і т.д., що були заготовлені з розчином І2 в KI. Якщо після першого перенесення в пробірці спостерігають фіолетове або червоне забарвлення, то інтервал між перенесенням скорочують до 30 секунд.
Якщо у черговій пробі спостерігається жовтий колір розчину йоду, гідроліз крохмалю вважається закінченим. Відзначають час повного гідролізу. Спостерігають зникнення опалесценції розчину в процесі гідролізу. Через 10 хв у пробірці з реакційною сумішшю проводять пробу Тромера.
Для проведення проби Тромера до вмісту пробірки з реактивною сумішшю додають рівний об’єм 10 % розчину NaOH і 5-7 крапель 5 % розчину CuSO4.Вміст пробірки перемішують до зникнення помутніння. Верхню частину пробірки обережно нагрівають на відкритому вогні до кипіння, реакція Тромера повинна бути позитивною, що відзначають за зміною забарвлення з синього до червоного.
Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.