Принцип методу. Метод ґрунтується на здатності пептидаз гідролізувати пептидні зв’язки, що приводить до зростання кількості вільних аміно- та карбоксильних груп. Після блокування аміногруп формаліном, карбоксильні групи підвищують кислотність середовища, приріст якого визначається титруванням лугом за методом Зернсена в присутності індикатора фенолфталеїну.
Матеріальне забезпечення: 6 % розчин казеїну, фосфатний буфер рН 7,6, панкреатин, фенолфталеїн, 0,2 н розчин NaОН, 0,02н розчин NaОН, формольна суміш рН 8,3, штатив з пробірками, піпетки, колбочки для титрування, бюретка, водяна баня, термометр, газовий пальник.
Хід роботи. У дві пробірки відмірюють по 5 мл 6 % розчину казеїну і по 2 мл фосфатного буферу рН 7,6. В одну з пробірок додають 0,5 г панкреатину, старанно перемішують і ставлять у водяну баню при температурі 370С разом з контрольною пробіркою.
Через 30 хв пробірки знімають з бані, охолоджують, їх вміст переливають у колбочки для титрування, додають в кожну по 2-3 краплі фенолфталеїну і підлужнюють з піпетки 0,2 н розчином NaОН до утворення блідорожевого забарвлення (рН-8,3).
При такому рН кількість аміногруп у розчині дорівнює кількості карбоксильних груп. Далі в обидві колбочки додають по 5 мл формольної суміші (рН-8,3). Формалін зв’язує аміногрупи, а карбоксильні групи зсувають рН розчину в кислу сторону. Розчин знебарвлюється. Обидві проби титрують із бюретки 0,02 н розчином NaOH до утворення слабо-рожевого забарвлення (рН 8,3) і додають ще декілька крапель 0,02 н розчину NаОН до яскраво червоного кольору (рН 9,1).
Вираховують різницю між даними титрування досліджуваного і контрольного розчинів. Активність пептидаз виражають в умовних одиницях. Одна умовна одиниця відповідає 1 мл 0,02 н розчину NаОН, затраченого додатково на титрування дослідної проби.
Приклад розрахунку:
Кількість 0,02 н NаОН, що пішла на титрування гідролізату казеїну ............. мл.
Кількість 0,02 н NаОН, що пішла на титрування контрольного розчину ...…. мл.
Різниця у кількості 0,02 н NaOH між дослідним і контр. розчином ................. мл.
Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.
Клініко-діагностичне значення.У нормі активність пептидаз сироватки крові становить 0,2-1,7мкмоль/мл год. Збільшення вмісту пептидаз у сироватці крові та зростання їх активності спостерігається при гострому панкреатиті, виразковій хворобі, обширних опіках, гострому гепатиті. Зниження активності пептидаз може спостерігатися при емфіземі легень, цирозі печінки.