Принцип методаоснован на связывании фосфотриоз, образующихся после расщепления ферментом фруктозо-1-фосфата, гидразином, с последующим определением триоз, освобождающихся при щелочном гидролизе продуктов динитрофенилгидразиновой реакции.
Ход работы. В пробирку внести 1 мл сыворотки крови и 0,5 мл субстратного раствора (100 мл бариевой соли фруктозо-1-фосфата растворить в 180 мл дистиллированной воды, прибавить 82 мл гидразин-гидрохлорида и довести рН до 7,4, добавляя 0,75н. NаОН, прилить веронал-мединаловой буфер рН 7,4 до конечного объема 400 мл).
В контрольную пробирку внести 1 мл сыворотки крови. Инкубировать в термостате контрольную и опытную пробу 30 мин при 37°С. После инкубации в контрольную пробирку добавить 0,5 мл субстратного раствора. Остальные реактивы приливать в обе пробирки одновременно. Для дефосфорилирования образовавшейся фосфотриозы прибавить по 1 мл 0,75 н NаОН и оставить при комнатной температуре на 30 мин. Добавить по 0,5 мл 2,4-динитрофенилгидразина 0,1 % раствора в 2 н НСI (500 мл 2,4-ДНФГ растворяют в 80 мл концентрированной НСI при слабом нагревании и доводят до 500 мл водой) и оставить на 30 мин. Затем добавить по 3 мл 0,75 н NаОН и через 5 минут опытную пробу колориметрировать на ФЭКе при зеленом светофильтре против контроля.
Расчет.Количество образовавшихся триоз определить по стандартной кривой, построенной по диоксиацетону. Активность фермента рассчитать по формуле А=а/Т, где А – активность фермента (мкмоль) в 1 мл сыворотки за 1 мин; а – количество образовавшихся триоз, рассчитанное по стандартной калибровочной кривой; Т – время инкубации (мин).
Клинико-диагностическое значение.Активность альдолазы в сыворотке крови увеличивается при инфекционном гепатите, токсических поражениях печени и некоторых других заболеваниях.