Принцип метода.Метод основан на окислении индигокармина кислородом, выделяющемся при разложении перекиси водорода под влиянием пероксидазы. Активность фермента измеряется временем, необходимым для окисления индигокармина, который меняет окраску от сине-зеленого в желто-розовый цвет. Чем меньше время окисления, тем выше активность фермента.
Ход работы.В пробирку налить 2 мл 0,1 М ацетатного буфера рН 4,7, прибавить 3 мл разбавленной в 1000 раз крови (см. работу 2), 2 мл дистиллированной воды и 1 мл 0,001% раствора индигокармина. Содержимое пробирки тщательно перемешать и быстро внести в нее 2 мл 0,2 % раствора Н2О2. В момент внесения Н2О2 засечь по секундомеру время и зафиксировать время перехода сине-зеленой окраски в желто-розовую.
Расчет.Пероксидазное действие крови связано с количеством гемоглобина, количество которого у разных людей отличается, поэтому определяется индекс пероксидазной реакции. Это отношение времени окисления индигокармина, к процентному содержанию гемоглобина в крови, умноженное на 100%.
Примерный расчет. Допустим, что переход окрашивания жидкости произошел за 8 секунд, а количество гемоглобина в исследуемой крови составляет 80% (160 г/л гемоглобина принято принимать за 100%); следовательно, индекс пероксидазной активности будет равен:
8 сек × 100% = 10
80%
В норме пероксидазная активность крови колеблется от 30 до 50 секунд.