А) Растворение солей костной ткани. Навеску кости перенести в колбу, прилить 10 мл 2 н раствора соляной кислоты, закрыть пробкой с обратным холодильником, поместить на сетку и нагреть до полного растворения кости. Содержимое колбы перенести в мерную колбу на 250 мл, внести 10 мл 2 н раствора едкого натра для нейтрализации содержимого и довести водой до метки.
Б) Открытие ионов кальция. К 10 каплям минерализата кости добавить 10 капель оксалата аммония, выпадает осадок.
В) Открытие неорганического фосфора. К 10 каплям минерализата кости прибавить 15 капель молибденового реактива и нагреть. Появляется осадок желтого цвета.
Г) Открытие сульфатов. К 10 каплям минерализата кости добавить 3 капли уксусной кислоты и 5 капель раствора хлористого бария. Выпадает осадок.
Д) Определение количества неорганического фосфора в костной ткани. Основано на способности фосфатов, содержащихся в минерализате, образовывать с молибденовым аммонием фосфомолибдат желтого цвета, который восстанавливается аскорбиновой кислотой в соединение, имеющее синюю окраску. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству неорганического фосфора.
Ход работы.В пробирку внести 0,5 мл минерализата, 5 мл дистиллированной воды, 1 мл 2,5 % раствора молибденовокислого аммония, 0,4 мл 0,25% раствора аскорбиновой кислоты. Перемешать стеклянной палочкой и оставить стоять на 15 мин, затем колориметрировать на ФЭКе с красным светофильтром (635 нм) против воды. Подсчет количества фосфора произвести по калибровочному графику или по стандартному раствору фосфата калия, содержащего 0,04 мг фосфора в 1 мл. С ним проводят параллельно все реакции.
Е) Определение количества ионов кальция в костной ткани. Са2+ в кости определяют комплексонометрическим методом, титруя Са2+ раствором комплексона, который связывает эти ионы в практически недиссоцирующий комплекс. Момент полного связывания Са2+ узнается по изменению цвета индикатора мурексида. В качестве комплексонообразователя при определении Са2+ применяют натриевую соль ЭДТА (трилон Б).
Ход работы.В колбу налить 25 мл дистиллированной воды и внести пипеткой 0,25 мл 9 н раствора едкого натра. Добавить несколько кристаллов мурексида. Внести в колбу 1 мл гидролизата кости и титровать из бюретки раствором ЭДТА до перехода окраски в сине-фиолетовую (переход окраски в точке эквивалентности не очень четкий).
Расчет.Содержание ионов кальция вычислить по формуле:
Концентрация Са2+ (г) = 0,002×40,8×100×а×250/1×Р×1000 = 6,8×а, где
где: 250 - степень разведения;
0,002 – молярность раствора ЭДТА;
40,8 – атомный вес кальция;
1 - объем минерализата, взятый для исследования;
100 – пересчет в%;
а – количество ЭДТА, пошедшего на титрование;
Р – навеска кости (0,3 г);
1000 – перевод в граммы.