Принцип метода. Белки крови осаждаются трихлоруксусной кислотой и отделяются центрифугированием. Центрифугат обрабатывается орто-толуидиновым реактивом.
Глюкоза при нагревании с о-толуидином в кислой среде дает зеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы в крови и определяется колориметрически на ФЭКе.
Ход определения. В центрифужную пробирку налить 0,9 мл 3% раствора трихлоруксусной кислоты и выдуть на стенку пробирки 0,1 мл крови, взятой из пальца. Содержимое пробирки взболтать и центрифугировать 5-7 мин при 1500 об/мин.
Взять две пробирки. В первую (опыт) прилить 0,5 мл центрифугата, во вторую (контроль) - 0,5 мл 3% раствора трихлорукусусной кислоты и в обе пробирки добавить по 4,5 мл 0-толуидинового реактива. Пробирки поместить на 8 мин (точно!) в кипящую водяную баню и сразу охладить под водопроводной водой до комнатной температуры.
Опытную пробу колориметрировать против контроля или дистиллированной воды на ФЭКе в кювете толщиной слоя 10 мм при красном (600-650 нм) или желтом (595 нм) светофильтре.
Расчет произвести по калибровочному графику или с применением стандартного раствора глюкозы.
Стандартная проба.Стандартную пробу проводят как опытную, но вместо крови используют стандартный раствор глюкозы с концентрацией 5,55 ммоль/л (1,0 г/л), а в случае высокого содержания сахара в крови 16,65 ммоль/л (3,0 г/л) или 27,75 ммоль/л (5,0 г/л).
Расчет произвести по формуле:
Соп = (Сст × Еоп) / Ест = ммоль/л глюкозы или г/л глюкозы, где
Соп - концентрация глюкозы в опытной пробе в ммоль/л или г/л,
Сст - концентрация глюкозы в стандартной пробе в ммоль/л или г/л,
Еоп - оптическая плотность опытной пробы,
Ест - оптическая плотность стандартного раствора глюкозы.
Работа № 3. Качественное обнаружение глюкозы в моче при помощи индикаторной бумаги «Глюкотест».
Принцип метода. “Глюкотест” приготавливается путем пропитки полосок фильтровальной бумаги 0,5х5 см смесью, содержащей глюкозооксидазу, пероксидазу и краситель. При смачивании бумаги раствором, содержащим глюкозу, происходит окисление глюкозы под действием фермента глюкозооксидазы. Образующаяся при этом перекись водорода разлагается ферментом пероксидазой с окислением содержащего в тесте красителя. Интенсивность изменения окраски в определенной степени пропорциональна содержанию глюкозы в растворе, поэтому “Глюкотест” используется и для полуколичественного определения содержания глюкозы в моче (от 1,0 до 20 г/л и выше).
Ход работы. Бумажку “Глюкотест” погрузить в исследуемую мочу так, чтобы нанесенная на бумажку желтая полоса была смочена. Немедленно извлечь бумажку, положить смоченным концом на пластмассовую пластинку и через 2 мин сравнить изменившуюся окраску цветной полосы со шкалой, имеющейся в комплекте. Содержание глюкозы в моче определяют по наиболее совпадающему со шкалой цвету полоски.
Клинико-диагностическое значение определения содержания глюкозы в моче.В моче здорового человека глюкоза практически не обнаруживается. В суточном количестве мочи может содержаться до 125-130 мг глюкозы. Почечный порог глюкозы зависит от величины гипергликемии, продолжительности ее, состояния почек и многих других причин. Различают гипергликемическую глюкозурию и нормогликемическую. Концентрационный почечный порог – предельно низкая концентрация вещества, при которой оно появляется в моче - для глюкозы – 9-10 ммоль/л. Нормогликемическая глюкозурия связана, главным образом, с нарушением реабсорбции глюкозы в почечных канальцах.