Принцип метода. Альфа-амилаза катализирует гидролиз нерастворимого цветного крахмального субстрата с образованием синего растворимого в воде красителя. Количество освобожденного красителя пропорционально активности фермента.
Ход определения. Для определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови или моче готовят параллельно опытную и контрольную пробы и анализируют в следующей последовательности:
| Компоненты | Пробы крови, мл | Пробы мочи, мл | ||
| опытная | контрольная | опытная | контрольная | |
| Суспензия субстрата | ||||
| Инкубация в течение 5 мин. при + 37°С | ||||
| Сыворотка крови | 0,10 | - | - | - |
| Моча | - | - | 0,05 | - |
| Дистиллированная вода | - | 0,10 | - | 0,05 |
| Инкубация в течение 15 мин. при 37°С | ||||
| Осаждающий раствор | ||||
| Активность амилазы | Норма: 130-150 Е/л | Норма: 1,00-2,00 Е/мл |
Пробы перемешивают, оставляют стоять на 15 мин, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Затем измеряют оптическую плотность опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 590 нм в кюветах с толщиной слоя 5,0 мм.
Активность фермента находят по калибровочному графику.
Клинико-диагностическое значение определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови и моче:у человека альфа-амилаза секретируется поджелудочной и слюнными железами, небольшая ее активность обнаруживается в ткани печени и скелетной мускулатуры. Молекулярная масса фермента относительно низка (»48000), поэтому он фильтруется в клубочках почек и содержится в моче.
У здоровых людей в сыворотке активность фермента от 140 до 350 Е/л, в моче - от 1000 до 2000 Е/л. Активность амилазы увеличивается, главным образом, при заболеваниях поджелудочной железы (при остром панкреатите). К повышению активности альфа-амилазы сыворотки крови приводят заболевания слюнных желез, хронические заболевания почек.