Поддержание (хранение) культур микроорганизмов. - раздел Химия, «ОРГАНИЗАЦИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАНТА ХИМИКО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА» Учебное пособие Основная Задача Хранения Культур – Поддержание Их Жизнеспособности, Сохранени...
Основная задача хранения культур – поддержание их жизнеспособности, сохранение стабильности таксономически важных признаков, а также определенных свойств, представляющих интерес для науки и практики. Проблема длительного хранения микроорганизмов сводится к созданию условий анабиоза, т. е. торможению процессов обмена веществ. Хранение микроорганизмов осуществляется в специальных коллекциях типовых культур. В коллекциях жизнеспособность микроорганизмов поддерживается преимущественно следующими методами: 1) периодическими пересевами (субкультивирование); 2) под минеральным маслом; 3) высушиванием; 4) лиофилизацией; 5) в условиях низких и ультранизких температур.
Субкультивирование – традиционный метод хранения культур (чаще всего аспорогенных) и заключается он в пересевах культур на свежие питательные среды один-два раза в месяц. Между пересевами микроорганизмы хранят в темноте при температурах 5 – 20 °С. При использовании этого метода хранения культур должны быть соблюдены три условия: 1) подходящая поддерживающая среда; 2) идеальная температура хранения; 3) необходимая частота пересевов. Преимуществом метода является простота и удобный визуальный контроль за чистотой культуры или ее морфологической изменчивостью, а к недостаткам следует отнести возможность заражения, краткосрочность хранения, трудоемкость работы и большой расход реактивов.
Хранение под минеральным маслом заключается в следующем: культуру микроорганизмов выращивают на благоприятной агаризованной питательной среде и заливают стерильным вазелиновым маслом. Слой масла (0,5 – 1,0 см) замедляет скорость обменных процессов микроорганизмов и предохраняет поверхность среды от высыхания. Покрытые маслом культуры хранят в холодильнике. Большинство сапрофитных бактерий сохраняют жизнеспособность в течение 8 – 14 лет, дрожжи и мицелиальные грибы пересевают через 2 – 3 года. Хранение под маслом имеет следующие преимущества: относительно длительное сохранение стабильности свойств микроорганизмов, сокращение затрат на пересевы.
Высушивание – простейший метод хранения микроорганизмов, в процессе которого происходит обезвоживание микробных клеток. В высушенных (до остаточной влажности 10 – 12 %) клетках биохимические реакции приостанавливаются или протекают очень медленно.
Процесс высушивания лучше всего переносят спорообразующие виды. Так, споры Bacillus anthrаcis, приготовленные еще Л. Пастером, остались жизнеспособными через 68 лет хранения. Широко применяют воздушное высушивание микроорганизмов на различных адсорбентах: в стерильной почве, песке, глине, фильтровальной бумаге, стеклянных бусах, крахмале и т. д. Адсорбенты защищают микроорганизмы от сильного высыхания, связывают свободную воду и поддерживают определенный уровень влажности. Разновидностью метода является L-высушивание, или высушивание из жидкого состояния: микроорганизмы в суспензионной среде высушивают под вакуумом в стеклянных ампулах, погруженных в водяную баню с контролируемой температурой. Высушенные культуры микроорганизмов легко хранить и транспортировать, они широко используются для хранения хлебопекарных и кормовых дрожжей, бактериальных удобрений (нитрагин, азотобактерин), энтомопатогенных препаратов.
Лиофилизация заключается в удалении воды из замороженных суспензий под вакуумом, т. е. при этом вода испаряется, минуя жидкую фазу. Этот метод считается одним из самых экономичных и эффективных методов длительного хранения микроорганизмов. При его использовании многие разнородные группы бактерий и бактериофагов сохраняются в жизнеспособном состоянии 30 и более лет. Выживаемость лиофилизированных клеток зависит от специфических особенностей вида и штамма, стадии роста и концентрации клеток, состава защитных сред, режима лиофилизации, условий реактивации. При подготовке клеток к лиофилизации их концентрированную суспензию(109 – 10¹ºкл/мл) переносят в среду, содержащую протекторы: сыворотку крови, желатин, молоко, полиэтиленгликоль, сахарозу, глюкозу, аспартат натрия и др. и затем по 0,2 мл помещают в специальные ампулы. Для лиофилизации используют различные аппараты, простейшим из которых является эксикатор, который охлаждают, чтобы клеточная суспензия во время подключения к вакууму оставалась замороженной. Длительность замораживания – высушивания – 5 – 6 часов.
Ампулы запаивают под вакуумом и хранят при 4°С в темноте. После лиофилизации для выведения клеток из состояния анабиоза создают условия, снижающие осмотический шок и стресс, возникающий при вскрытии ампул. Лучше всего восстановление свойств происходит на богатых натуральных средах.
Хранение микроорганизмов при низких и ультранизких температурах используется в тех случаях, когда культуры не выдерживают лиофилизации (некоторые автотрофные бактерии, спирохеты, микоплазмы, водные фикомицеты, различные вирусы). Микроорганизмы замораживают либо в рефрижераторах (от – 12 °С до – 80 °С) либо используют рефрижераторы с азотом: газово-фазовый (– 150 °С) или жидко-фазовый ( –196 °С). Считается, что грамположительные бактерии более устойчивы к замораживанию, чем грамотрицательные.
При хранении бактерий в жидком азоте используют криопротекторы двух типов: глицерин и диметилсульфоксид, которые легко проходят через клеточную мембрану и обеспечивают как внутри – так и внеклеточную защиту; сахароза, глюкоза, полиэтиленгликоль обеспечивают защитное действие на наружной поверхности клеточной мембраны.
По 0,4 мл суспензии клеток (108 кл/мл) разливают в специальные ампулы, которые запаивают. Далее проводят двухэтапное охлаждение: с медленной (снижение температуры 1°С / мин) и быстрой (снижение температуры 15 – 30°С / мин) скоростью. Чтобы оживить замороженные культуры, их быстро оттаивают при 37 °С. К основным преимуществам криогенного сохранения микроорганизмов можно отнести:
малую вероятность заражения культуры, сохранение в стабильном состоянии свойств микроорганизмов, небольшие временные и материальные затраты, возможность использования замороженных культур в качестве прямого инокулята.
Сравнительный анализ использования различных методов хранения культур микроорганизмов приведен в табл. 1.
Таблица 1
Все темы данного раздела:
И.С.Корешкова
«ОРГАНИЗАЦИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАНТА ХИМИКО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА»
Учебное пособие
для студентов СПО
Техника безопасности в химической лаборатории
1. Работать одному в лаборатории строго запрещается.
2. Нельзя работать в лаборатории без халата. Он должен быть сшит только из хлопчатобумажной ткани.
3.На лабора
Правила поведения при несчастных случаях
1. При ожоге концентрированными кислотами необходимо промыть
обожженное место струей воды, а затем — 2 — 3%- ным раствором соды.
2. При ожоге едкими щелочами постр
Требования к помещению химической лаборатории
Помещение лаборатории должно быть по возможности просторным и светлым. Лабораторию не следует устраивать в таком месте, где по тем или иным причинам происходит вибрация здания, так как это мешает р
Требования к помещению бактериологической лаборатории.
Помещение бактериологической лаборатории должно быть светлым и просторным. Необходимо исключить возможность сквозняков. Специальное место отводится для окраски препаратов. Обязательным оборудов
Организация рабочего места в лаборатории.
Правильная организация рабочего места — залог продуктивной работы лаборанта, от которой зависит точность и надежность выполняемых анализов. Чувство комфортности, устранение физического неудобства и
Химическая посуда, используемая в анализе
Химическую посуду, предназначенную для работы в аналитической лаборатории, можно условно разделить на две группы: посуда общего назначения и посуда специального назначения. К посуде общего назначен
Крепление бюретки для титрования
Бюксы стеклянные(рис.4)с притертыми крышками служат длявзвешивания твердых и жидких веществ, а также для их хранения.
Эрленмейера
Колбы для отсасывания (Бунзена) и воронки для фильтрования (Бюхнера) (рис.10).Колба Бунзена—толстостенная колба конической формы с отростком в верхней части (для соединения с
Центрифугата от осадка
Пипетки мерные(градуированные пипетки и пипетки Мора)длинные узкие трубки с расширением в середине (рис. 15). На узкой верхней части имеется специальная метка. Мерн
Пипеткой
Стеклянные палочки для перемешивания(рис.20).Обычнаядлина таких палочек 15 - 20 см, диаметр около 4 мм. На конце, который немного оттянут, имеется небольш
Химические
технический угловой.
Холодильники(рис.25)служат для охлаждения и конденсации пар
Работа с платиновой посудой
В аналитической практике широко используется платиновая посуда (тигли, чашки и т. д.). Но платина — драгоценный металл, поэтому при работе с платиновой посудой следует соблюдать спе
Правила работы с платиновой посудой
1.Не забывайте, что платина — очень мягкий металл. Поэтому при работе с платиновой посудой требуется особая осторожность, так как даже от незначительного усилия она легко деформируе
Требования к чистоте химической посуды
Приступать к выполнению химического анализа можно только тогда, когда под рукой у химика-аналитика будет необходимый набор химической посуды. Обязательно и другое требование: посуда всегда должна б
Химические методы очистки посуды
Мытье хромовой смесью. Очень часто в лабораториях для мытья посуды применяют хромовую смесь, так как хромовокислые соли в кислом растворе являются сильными окислителями. Для приготовления хромовой
Смешанные способы мытья посуды
Наилучшим примером сочетания различных способов очистки является мытье бюреток. Процесс мытья бюретки очень кропотливый и трудоемкий.
Сначала бюретку, если это необходимо, тщательно протир
Требования к чистоте бактериологической посуды
Посуда для бактериологических работ должна быть чистой, а для многих исследований — и стерильной, так как использование загрязненной, плохо вымытой посуды может привести к получению неправильных ре
Сушка химической посуды.
Иногда вымытая посуда должна быть хорошо высушена. Сухая посуда нужна, когда работу необходимо проводить в отсутствие следов влаги (очень многие органические реакции).
Различают: а) методы
Методы сушки при нагревании
Сушка горячим воздухом. Для ускорения сушки можно обдувать посуду горячим воздухом. Иногда посуду сушат над электроплиткой или над коптящим «холодным» пламенем горелки.
Нагревание следует
Виды стерилизации бактериологической посуды.
Стерилизация в отличие от дезинфекции предусматривает в стерилизуемом объекте уничтожение всех вегетативных и споровых, патогенных и непатогенных микроорганизмов. Стерилизацию производят различными
Тиндализация.
Тиндализация — дробная стерилизация с применением температуры ниже 100°С, предложенная Тиндалем. Прогревание стерилизуемого материала производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу
Дезинфекция
Уничтожение патогенных микробов в объектах внешней среды называется дезинфекцией. В микробиологических лабораториях дезинфекционные мероприятия используются очень широко. Оканчивая работу с заразны
Приборы, используемые в химическом анализе
Баня водяная(рис. 29) -применяется для нагревания растворов до100°С. Бани, бывают, различных конструкций (круглая или четырехугольная) со съемными кольцами для разм
Аналитические весы
Основным и наиболее точным измерительным инструментом лаборатории химических методов анализа являются аналитические весы. Они позволяют взвешивать вещества с точностью до 0,0001 - 0,0002 г (при мак
Основные правила при работе с весами модели ВЛР-200
1.Приступая к взвешиванию, постарайтесь удобно сесть перед весами. От этого во многом зависит точность взвешивания. Сидеть нужно строго напротив весов, но, не напрягаясь, иначе вы быстро устанете.
И ПРАВИЛА РАБОТЫ В НЕЙ
Микробиологические лаборатории обычно снабжены следующим оборудованием:
1. Биологическими иммерсионными микроскопами с дополнительными приспособлениями и наборами необходимых красителей.
Микробиологические боксы
Бокс (боксированные помещения или помещения, оснащенные боксами биологической безопасности) - защищенное от пыли рабочее место, оборудованное установкой для горизонтального или вертикального ламина
Обслуживание и контроль
рН-метр градуируют в соответствии с инструкциями изготовителя, используя не менее двух стандартных буферных растворов, не раньше, чем за день до применения. Значения рН стандартных растворов должны
Питательные среды.
Известно значительное количество питательных сред, используемых для культивирования и поддержания (сохранения) микроорганизмов.
Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащи
Основы приготовления питательных сред.
Питательные среды служат для выделения из исследуемого материала чистых культур микробов и изучения их свойств. Питательные среды являются основой бактериологических работ, нередко определяя своим
Техника посева микроорганизмов в жидкие питательные среды.
Посев микроорганизмов осуществляется бактериологической петлей. Отбор клеток микроорганизмов производят следующим образом. В правую руку берут петлю и стерилизуют ее нагреванием в пламени спиртовки
Техника посева микроорганизмов на агаризованную среду
Посев на скошенный агар в пробирках проводят следующим образом. Клетки микроорганизмов отбирают бактериологической петлей (как описано выше) и вводят петлю в пробирку со скошенной агаризованной сре
Техника культивирования анаэробных микроорганизмов
Граница между аэробными и анаэробными микроорганизмами является относительно условной. Хотя облигатными анаэробами обычно считают бактерии, рост которых невозможен в присутствии растворенного кисло
Различных методов их хранения
Род
бактерий
Частота пере-
севов,
месяцы
Время выживания, годы
Под мине-
ральным
маслом
В
стерил
Микроскопические методы исследования
Основными задачами микроскопии являются следующие:
• Выявление микроорганизмов в различных материалах.
• Ориентировочная идентификация микроорганизмов в исследуем
Морфология бактерий, структура и химический состав бактериальной клетки
Морфологические типы бактерий, в сравнении с высшими организмами, немногочисленны. Клетки большинства бактерий имеют сферическую, цилиндрическую или извитую форму, но существует небольшая группа ми
Эндоспоры бактерий
Спорообразование свойственно бактериям нескольких родов, к числу которых относятся Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desufotomaculum, etc. Обычно внутри каждой клетки образуется одна спора, кото
Капсула бактерий
При определенных условиях культивирования многие виды бактерий различных таксономических групп образуют слизистое вещество, формирующее вокруг клетки структуру, которая называется капсулой. Колонии
Цитоплазматические включения
У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включениями. Среди них – отложения жира, поли-β-гид
Подвижность бактерий
Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев светлопольный микроскоп. Наиболее эффективно наблюдение за подвижностью в тем
Количественный учет микроорганизмов.
О росте микроорганизмов в естественных субстратах или питательных средах судят по количеству клеток в единице объема. Данная величина носит название титра клеток (или фаговых частиц). Выбор метода
Подсчет клеток на мембранных фильтрах
Этот метод используют для подсчета количества микроорганизмов в жидких материалах с низкой плотностью клеток. Метод основан на концентрировании клеток на поверхности фильтра в результате фильтрации
Определение количества микробных клеток нефелометрическим методом
Этот метод широко применяется в микробиологических исследованиях, так как позволяет достаточно точно и сравнительно быстро определить количество клеток в культуральной среде. В основе метода лежит
Микроскопия микроорганизмов в окрашенном виде
Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают. Приготовление мазков. Исследуемый материал распределяют тонким
V. Требования, предъявляемые к методам анализа.
1.Правильность – параметр, характеризующий близость экспериментальных и истинных значений измеряемой величины. Она характеризуется систематической погрешностью, которая зави
Отбор проб
Перед исследованием вещество предварительно подготавливают к анализу. Отбор средней пробы является одной из важнейших подготовительных операций. Его цель – получить относительно небольшое количеств
Отбор проб продуктов питания
По физическим свойствам продукты питания делятся на две основные группы: жидкие и твердые.
Последние по глубине проникновения ТХВ могут быть подразделены на плотные (хлеб, мясо, рыба и т.
Общие принципы подготовки проб к анализу
Пробы, поступающие в лабораторию, осматривают, вскрывают упаковку и регистрируют в журнале в соответствии с сопроводительной документацией, удостоверяющей объект. При этом в лабораторном журнале от
Физический метод анализа
Эти методы основаны на использовании зависимости физических свойств вещества от их химического состава. Наиболее распространены следующие физические методы анализа.
1. Спектраль
Физические свойства жира
Жир
Коэффициент
преломления
Плотность,
г/см³
Подсолнечное
масло
1,4748
0,91
Физико-химический метод анализа
Особенно велика их роль в экологическом мониторинге. Лишь современные методы анализа, как спектроскопические, электрохимические, хроматографические и другие (среди них отметим масс– спектрометрию),
Фотометрический метод анализа. Фотометрия
Фотометрический метод анализа (Фотометрия), совокупность методов абсорбционного спектрального анализа, основанных на избирательном поглощении электромагнитного излучения в видимой,
Методы определения рН
Для определения значения pH растворов широко используют несколько методик. Водородный показатель можно приблизительно оценивать с помощью индикаторов, точно измерять pH-метром или определять аналит
Техника приготовления растворов.
Независимо от того, какие (поточности) приготовляют растворы, применять следует только чистые растворители. Если растворителем служит вода, то можно применять только дистиллированную или деминерали
Расчеты при приготовлении водных растворов
Приблизительные растворы. При приготовлении приблизительных растворов количества веществ, которые должны быть взяты для этого, вычисляют с небольшой точностью. Атомные веса элемент
Растворы солей
Приблизительные растворы. Растворы солей готовят, как указано выше. Готовый раствор или отфильтровывают, или дают ему отстояться от нерастворимых в воде примесей,
Растворы щелочей
Приблизительные растворы. Наиболее употребительными растворами щелочей в лабораторной практике являются растворы едкого натра NaOH. Растворы едкого кали KOH готовят редко, растворы
Растворы кислот
Приблизительные растворы. В большинстве случаев в лаборатории приходится пользоваться соляной, серной и азотной кислотами. Кислоты имеются в продаже в виде концентрированных раство
Фиксаналы
Для быстрого приготовления точных растворов различных веществ (кислот, щелочей и солей) удобно применять фиксаналы. Это — заранее приготовленные и запаянные в стеклянных ампулах точно отвешенны
Индикаторы
Индикаторами называют вещества, применяемые при объемно-аналитических определениях и в некоторых других случаях для определения конца реакции.
Момент окончания реакции определяют или по из
Обесцвечивание растворов.
Растворы многих, преимущественно органических, веществ, приготовленные из технических препаратов, часто имеют окраску. Она вызывается присутствием в растворе примесей, главным образом смолистого ха
Новости и инфо для студентов