Определение количества микробных клеток нефелометрическим методом - раздел Химия, «ОРГАНИЗАЦИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАНТА ХИМИКО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА» Учебное пособие Этот Метод Широко Применяется В Микробиологических Исследованиях, Так Как Поз...
Этот метод широко применяется в микробиологических исследованиях, так как позволяет достаточно точно и сравнительно быстро определить количество клеток в культуральной среде. В основе метода лежит измерение количества света, рассеянного взвесью клеток. Микроорганизмы в большинстве случаев не окрашены и почти прозрачны, поэтому суспензии клеток в видимой области спектра поглощают свет незначительно. Уменьшение интенсивности света после его прохождения через взвесь клеток связано, главным образом, с его рассеиванием. В определенных пределах рассеивание света клетками пропорционально их численности. Следует помнить, что количество рассеянного света пропорционально отношению размера частицы к длине волны падающего света. Поэтому при постоянной длине волны падающего света, светорассеяние зависит от размеров клетки и будет тем большим, чем крупнее клетки и измерение светорассеяния целесообразно для тех культур микроорганизмов, развитие которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клетки, образованием мицелия, пленок и других скоплений.
Величину светорассеяния измеряют с помощью нефелометров, спектрофотометров или фотоэлектроколориметров. В этих приборах измеряется первичный пучок света, который проходит через пробу и, не отклоняясь, падает на фотоэлемент. Обычно при этом сравнивается интенсивность света, проходящего через суспензию клеток и через среду без клеток. Для измерения светорассеяния выбирают светофильтр, обеспечивающий максимум пропускания света данной взвесью. Питательная среда для культивирования микроорганизмов, в которой предполагается определять количество клеток по рассеиванию, должна быть оптически прозрачной.
Количество клеток определяют по калибровочной кривой, отображающей зависимость между величиной светорассеяния и числом клеток в единице объема исследуемой взвеси. Для построения калибровочной кривой поступают следующим образом. Измеряют величин светорассеяния взвеси с различным содержанием клеток и в каждой из них одним из доступных способов подсчитывают количество клеток в единице объема. Полученную зависимость выражают графически, откладывая на осях: абсцисс – показания нефелометра, ординат – количество клеток, содержащихся в 1 мл. Калибровочные кривые индивидуальны для каждой культуры; для определенных условий выращивания культуры (состав среды, температура, аэрация и т. д.).
5. Определение количества жизнеспособных клеток путем высева на питательные среды (чашечный метод Коха)
Сущность метода подсчета количества клеток путем высева заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на агаризованную питательную среду в чашках Петри и подсчете формирующихся колоний, принимая во внимание, что каждая колония – потомство одной жизнеспособной клетки. Существует много вариантов метода.
При посеве на поверхность агара (метод Коха) проводят три этапа: приготовление разведений исследуемого материала, посев на агаризованную среду в чашках Петри и подсчет сформировавшихся колоний.
Для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений, так как численность микробных популяций обычно достаточно велика. Разведения готовят в физиологическом растворе, используя шаг разведения 10-1. Для этого стерильный физиологический раствор разливают по 4,5 мл в стерильные пробирки, соблюдая правила асептики. Затем 0,5 мл исследуемого материала стерильной пипеткой вносят в пробирку с 4,5 мл физиологического раствора и считают это разведение первым (10-1). Содержимое пробирки тщательно перемешивают, новой пипеткой отбирают 0,5 мл суспензии и переносят во вторую пробирку, получая при этом второеразведение (10-2). Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов: чем она выше, тем больше разведений следует использовать.
При проведении посева на поверхность подсушенной агаризованной питательной среды в чашке Петри стерильной пипеткой наносят точно отмеренный объем (0,1 мл) соответствующего разведения взвеси микроорганизмов и распределяют стерильным шпателем по всей поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем делают два параллельных высева на отдельные чашки. Посев из каждого разведения следует проводить новой стерильной пипеткой и заново стерилизовать шпатель. После посева чашки помещают в термостат крышками вниз.
Подсчет выросших колоний осуществляют обычно через сутки для большинства бактериальных клеток, через 5 – 7 суток для грибов и дрожжей, а колонии актиномицетов учитывают через 7 – 14 суток инкубирования.
При расчете количества клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии суммируют результаты параллельных высевов из одного и того же разведения и определяют среднее количество колоний для данного разведения. Лучшим разведением следует считать то, при высеве из которого на агаризованной питательной среде сформировалось от 30 до 300 колоний. Нижний предел устанавливается из соображений статистической достоверности, а верхний – из-за опасности слияния индивидуальных колоний. Полученные данные подставляют в
формулу:
M = a x 10ⁿ
V
где М – количество клеток в 1 мл; а – среднее количество колоний при высеве из данного разведения; V – объем суспензии в мл, взятой для посева; 10 – коэффициент разведения; n – порядковый номер разведения.
Метод посева в агаризованную среду осуществляют путем внесения в стерильную чашку Петри суспензии микроорганизмов из соответствующего разведения с последующим заливанием расплавленной и охлажденной до 450 агаризованной средой. Содержимое чашки перемешивают и дают среде застыть.
Метод посева в тонком слое предполагает внесение разведенной суспензии микроорганизмов в пробирки с небольшим объемом (2,5 – 3,5 мл) расплавленной полужидкой агаризованной средой, которую затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшей агаризованной среды и дают застыть верхнему слою.
Каждый из вышеперечисленных методов посева имеет свою область использования и определенные ограничения. При посеве на поверхность агаризованной среды все выросшие колонии являются поверхностными. Именно в этом случае изучают характерные изменения в индикаторных агаровых средах. При посеве в агаризованные среды колонии, как правило, компактны и невелики по размерам, так как формируются под слоем агара, что дает возможность учета большего их количества. Вторым преимуществом метода является возможность дополнительных манипуляций с составом среды: верхний и нижнийслой могут содержать разные питательные добавки. Кроме того, к верхнему слою могут быть добавлены красители для облегчения обнаружения колоний.
Все темы данного раздела:
И.С.Корешкова
«ОРГАНИЗАЦИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАНТА ХИМИКО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА»
Учебное пособие
для студентов СПО
Техника безопасности в химической лаборатории
1. Работать одному в лаборатории строго запрещается.
2. Нельзя работать в лаборатории без халата. Он должен быть сшит только из хлопчатобумажной ткани.
3.На лабора
Правила поведения при несчастных случаях
1. При ожоге концентрированными кислотами необходимо промыть
обожженное место струей воды, а затем — 2 — 3%- ным раствором соды.
2. При ожоге едкими щелочами постр
Требования к помещению химической лаборатории
Помещение лаборатории должно быть по возможности просторным и светлым. Лабораторию не следует устраивать в таком месте, где по тем или иным причинам происходит вибрация здания, так как это мешает р
Требования к помещению бактериологической лаборатории.
Помещение бактериологической лаборатории должно быть светлым и просторным. Необходимо исключить возможность сквозняков. Специальное место отводится для окраски препаратов. Обязательным оборудов
Организация рабочего места в лаборатории.
Правильная организация рабочего места — залог продуктивной работы лаборанта, от которой зависит точность и надежность выполняемых анализов. Чувство комфортности, устранение физического неудобства и
Химическая посуда, используемая в анализе
Химическую посуду, предназначенную для работы в аналитической лаборатории, можно условно разделить на две группы: посуда общего назначения и посуда специального назначения. К посуде общего назначен
Крепление бюретки для титрования
Бюксы стеклянные(рис.4)с притертыми крышками служат длявзвешивания твердых и жидких веществ, а также для их хранения.
Эрленмейера
Колбы для отсасывания (Бунзена) и воронки для фильтрования (Бюхнера) (рис.10).Колба Бунзена—толстостенная колба конической формы с отростком в верхней части (для соединения с
Центрифугата от осадка
Пипетки мерные(градуированные пипетки и пипетки Мора)длинные узкие трубки с расширением в середине (рис. 15). На узкой верхней части имеется специальная метка. Мерн
Пипеткой
Стеклянные палочки для перемешивания(рис.20).Обычнаядлина таких палочек 15 - 20 см, диаметр около 4 мм. На конце, который немного оттянут, имеется небольш
Химические
технический угловой.
Холодильники(рис.25)служат для охлаждения и конденсации пар
Работа с платиновой посудой
В аналитической практике широко используется платиновая посуда (тигли, чашки и т. д.). Но платина — драгоценный металл, поэтому при работе с платиновой посудой следует соблюдать спе
Правила работы с платиновой посудой
1.Не забывайте, что платина — очень мягкий металл. Поэтому при работе с платиновой посудой требуется особая осторожность, так как даже от незначительного усилия она легко деформируе
Требования к чистоте химической посуды
Приступать к выполнению химического анализа можно только тогда, когда под рукой у химика-аналитика будет необходимый набор химической посуды. Обязательно и другое требование: посуда всегда должна б
Химические методы очистки посуды
Мытье хромовой смесью. Очень часто в лабораториях для мытья посуды применяют хромовую смесь, так как хромовокислые соли в кислом растворе являются сильными окислителями. Для приготовления хромовой
Смешанные способы мытья посуды
Наилучшим примером сочетания различных способов очистки является мытье бюреток. Процесс мытья бюретки очень кропотливый и трудоемкий.
Сначала бюретку, если это необходимо, тщательно протир
Требования к чистоте бактериологической посуды
Посуда для бактериологических работ должна быть чистой, а для многих исследований — и стерильной, так как использование загрязненной, плохо вымытой посуды может привести к получению неправильных ре
Сушка химической посуды.
Иногда вымытая посуда должна быть хорошо высушена. Сухая посуда нужна, когда работу необходимо проводить в отсутствие следов влаги (очень многие органические реакции).
Различают: а) методы
Методы сушки при нагревании
Сушка горячим воздухом. Для ускорения сушки можно обдувать посуду горячим воздухом. Иногда посуду сушат над электроплиткой или над коптящим «холодным» пламенем горелки.
Нагревание следует
Виды стерилизации бактериологической посуды.
Стерилизация в отличие от дезинфекции предусматривает в стерилизуемом объекте уничтожение всех вегетативных и споровых, патогенных и непатогенных микроорганизмов. Стерилизацию производят различными
Тиндализация.
Тиндализация — дробная стерилизация с применением температуры ниже 100°С, предложенная Тиндалем. Прогревание стерилизуемого материала производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу
Дезинфекция
Уничтожение патогенных микробов в объектах внешней среды называется дезинфекцией. В микробиологических лабораториях дезинфекционные мероприятия используются очень широко. Оканчивая работу с заразны
Приборы, используемые в химическом анализе
Баня водяная(рис. 29) -применяется для нагревания растворов до100°С. Бани, бывают, различных конструкций (круглая или четырехугольная) со съемными кольцами для разм
Аналитические весы
Основным и наиболее точным измерительным инструментом лаборатории химических методов анализа являются аналитические весы. Они позволяют взвешивать вещества с точностью до 0,0001 - 0,0002 г (при мак
Основные правила при работе с весами модели ВЛР-200
1.Приступая к взвешиванию, постарайтесь удобно сесть перед весами. От этого во многом зависит точность взвешивания. Сидеть нужно строго напротив весов, но, не напрягаясь, иначе вы быстро устанете.
И ПРАВИЛА РАБОТЫ В НЕЙ
Микробиологические лаборатории обычно снабжены следующим оборудованием:
1. Биологическими иммерсионными микроскопами с дополнительными приспособлениями и наборами необходимых красителей.
Микробиологические боксы
Бокс (боксированные помещения или помещения, оснащенные боксами биологической безопасности) - защищенное от пыли рабочее место, оборудованное установкой для горизонтального или вертикального ламина
Обслуживание и контроль
рН-метр градуируют в соответствии с инструкциями изготовителя, используя не менее двух стандартных буферных растворов, не раньше, чем за день до применения. Значения рН стандартных растворов должны
Питательные среды.
Известно значительное количество питательных сред, используемых для культивирования и поддержания (сохранения) микроорганизмов.
Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащи
Основы приготовления питательных сред.
Питательные среды служат для выделения из исследуемого материала чистых культур микробов и изучения их свойств. Питательные среды являются основой бактериологических работ, нередко определяя своим
Техника посева микроорганизмов в жидкие питательные среды.
Посев микроорганизмов осуществляется бактериологической петлей. Отбор клеток микроорганизмов производят следующим образом. В правую руку берут петлю и стерилизуют ее нагреванием в пламени спиртовки
Техника посева микроорганизмов на агаризованную среду
Посев на скошенный агар в пробирках проводят следующим образом. Клетки микроорганизмов отбирают бактериологической петлей (как описано выше) и вводят петлю в пробирку со скошенной агаризованной сре
Техника культивирования анаэробных микроорганизмов
Граница между аэробными и анаэробными микроорганизмами является относительно условной. Хотя облигатными анаэробами обычно считают бактерии, рост которых невозможен в присутствии растворенного кисло
Поддержание (хранение) культур микроорганизмов.
Основная задача хранения культур – поддержание их жизнеспособности, сохранение стабильности таксономически важных признаков, а также определенных свойств, представляющих интерес для науки и практик
Различных методов их хранения
Род
бактерий
Частота пере-
севов,
месяцы
Время выживания, годы
Под мине-
ральным
маслом
В
стерил
Микроскопические методы исследования
Основными задачами микроскопии являются следующие:
• Выявление микроорганизмов в различных материалах.
• Ориентировочная идентификация микроорганизмов в исследуем
Морфология бактерий, структура и химический состав бактериальной клетки
Морфологические типы бактерий, в сравнении с высшими организмами, немногочисленны. Клетки большинства бактерий имеют сферическую, цилиндрическую или извитую форму, но существует небольшая группа ми
Эндоспоры бактерий
Спорообразование свойственно бактериям нескольких родов, к числу которых относятся Bacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desufotomaculum, etc. Обычно внутри каждой клетки образуется одна спора, кото
Капсула бактерий
При определенных условиях культивирования многие виды бактерий различных таксономических групп образуют слизистое вещество, формирующее вокруг клетки структуру, которая называется капсулой. Колонии
Цитоплазматические включения
У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включениями. Среди них – отложения жира, поли-β-гид
Подвижность бактерий
Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев светлопольный микроскоп. Наиболее эффективно наблюдение за подвижностью в тем
Количественный учет микроорганизмов.
О росте микроорганизмов в естественных субстратах или питательных средах судят по количеству клеток в единице объема. Данная величина носит название титра клеток (или фаговых частиц). Выбор метода
Подсчет клеток на мембранных фильтрах
Этот метод используют для подсчета количества микроорганизмов в жидких материалах с низкой плотностью клеток. Метод основан на концентрировании клеток на поверхности фильтра в результате фильтрации
Микроскопия микроорганизмов в окрашенном виде
Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают. Приготовление мазков. Исследуемый материал распределяют тонким
V. Требования, предъявляемые к методам анализа.
1.Правильность – параметр, характеризующий близость экспериментальных и истинных значений измеряемой величины. Она характеризуется систематической погрешностью, которая зави
Отбор проб
Перед исследованием вещество предварительно подготавливают к анализу. Отбор средней пробы является одной из важнейших подготовительных операций. Его цель – получить относительно небольшое количеств
Отбор проб продуктов питания
По физическим свойствам продукты питания делятся на две основные группы: жидкие и твердые.
Последние по глубине проникновения ТХВ могут быть подразделены на плотные (хлеб, мясо, рыба и т.
Общие принципы подготовки проб к анализу
Пробы, поступающие в лабораторию, осматривают, вскрывают упаковку и регистрируют в журнале в соответствии с сопроводительной документацией, удостоверяющей объект. При этом в лабораторном журнале от
Физический метод анализа
Эти методы основаны на использовании зависимости физических свойств вещества от их химического состава. Наиболее распространены следующие физические методы анализа.
1. Спектраль
Физические свойства жира
Жир
Коэффициент
преломления
Плотность,
г/см³
Подсолнечное
масло
1,4748
0,91
Физико-химический метод анализа
Особенно велика их роль в экологическом мониторинге. Лишь современные методы анализа, как спектроскопические, электрохимические, хроматографические и другие (среди них отметим масс– спектрометрию),
Фотометрический метод анализа. Фотометрия
Фотометрический метод анализа (Фотометрия), совокупность методов абсорбционного спектрального анализа, основанных на избирательном поглощении электромагнитного излучения в видимой,
Методы определения рН
Для определения значения pH растворов широко используют несколько методик. Водородный показатель можно приблизительно оценивать с помощью индикаторов, точно измерять pH-метром или определять аналит
Техника приготовления растворов.
Независимо от того, какие (поточности) приготовляют растворы, применять следует только чистые растворители. Если растворителем служит вода, то можно применять только дистиллированную или деминерали
Расчеты при приготовлении водных растворов
Приблизительные растворы. При приготовлении приблизительных растворов количества веществ, которые должны быть взяты для этого, вычисляют с небольшой точностью. Атомные веса элемент
Растворы солей
Приблизительные растворы. Растворы солей готовят, как указано выше. Готовый раствор или отфильтровывают, или дают ему отстояться от нерастворимых в воде примесей,
Растворы щелочей
Приблизительные растворы. Наиболее употребительными растворами щелочей в лабораторной практике являются растворы едкого натра NaOH. Растворы едкого кали KOH готовят редко, растворы
Растворы кислот
Приблизительные растворы. В большинстве случаев в лаборатории приходится пользоваться соляной, серной и азотной кислотами. Кислоты имеются в продаже в виде концентрированных раство
Фиксаналы
Для быстрого приготовления точных растворов различных веществ (кислот, щелочей и солей) удобно применять фиксаналы. Это — заранее приготовленные и запаянные в стеклянных ампулах точно отвешенны
Индикаторы
Индикаторами называют вещества, применяемые при объемно-аналитических определениях и в некоторых других случаях для определения конца реакции.
Момент окончания реакции определяют или по из
Обесцвечивание растворов.
Растворы многих, преимущественно органических, веществ, приготовленные из технических препаратов, часто имеют окраску. Она вызывается присутствием в растворе примесей, главным образом смолистого ха
Новости и инфо для студентов