Специфичность действия ферментов можно наблюдать на примере амилазы слюны, субстратом для которой является крахмал или гликоген.
Амилаза расщепляет крахмал через стадию декстринов до редуцирующего дисахарида – мальтозы.
О действии фермента можно судить или по исчезновению (расщеплению) субстрата или по образованию конечных продуктов его расщепления.
Принцип метода: -амилаза слюны катализирует гидролиз -1-4 гликозидных связей в крахмале и гликогене, что приводит к расщеплению (убыли) субстрата и появлению продуктов гидролиза – декстринов и дисахарида мальтозы. Определяя убыль субстрата (крахмала) с помощью реакции с реактивом Люголя (раствор йода в KI), судят о наличии в слюне фермента амилазы. Крахмал открывается пробой Люголя. Как известно, крахмал со свободным иодом дает синее окрашивание.
Конечные продукты расщепления крахмала можно обнаружить с помощью редуцирующих проб, например, пробой Фелинга. Реакция основана на способности углеводов восстанавливать металлы. При нагревании голубой гидрат окиси меди восстанавливается углеводом сначала в гидрат закиси меди желтого цвета, а при дальнейшем нагревании в закись меди кирпично-красного цвета.
Химизм реакции:
-амилаза -амилаза
( С6 Н10 О5)n +н2о декстрины +н2о n(С12 Н22 О11)
крахмал мальтоза
Ход работы:
В пробирку 1 отмерить 2 мл 0,5 раствора крахмала, в пробирку 2 – 2 мл 2% раствора сахарозы. В обе пробирки добавить по 1 мл разведенной в 10 раз слюны. Пробирки встряхнуть и поместить в термостат или водяную баню при температуре 38С на 10 минут. После этого с содержимым каждой пробирки проделать пробы Фелинга и Люголя. Для контроля провести с 0,5 % раствором крахмала пробу Люголя и пробу Фелинга с 2% раствором сахарозы.
| N пробирки | Источник фермента | Субстрат | Реакция с раствором Люголя (окраска) | Проба Фелинга | Вывод |