МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ ПЕПТИДНОЙ СВЯЗИ

Образование пептидной связи в общем сводится к отщеплению элементов воды. Чтобы обеспечить ее высокую скорость и полноту, необходимо «активировать» карбоксильную группу. Такая активация должна сводиться к увеличению электрофильности карбонильного углерода Сδ+.

Хлорангидридный метод. Хлорангидридный метод в настоящее время применяется редко, так как сопровождается рацемизацией и образованием побочных продуктов. Хлорангидриды получаются обычно обработкой и химической модификацией производных аминокислот и пептидов хлористым тионилом или белков и пептидов пятихлористым фосфором.

Азидный метод. Метод Т. Курциуса находит широкое применение в синтезе пептидов. Гидразиды получаются либо прямым гидразинолизом эфиров защищенных аминокислот или пептидов, либо из защищенных гидразидов (–СО–NH–NH–Z–, –СО–NH–NH–Вос и т. д.). Перевод в азиды осуществляется обработкой водным раствором нитрита натрия в кислой среде при 5 С или действием изоамилнитрита или трет-бутилнитрита при 20 С в органическом растворителе (модификация Хонцля и Рудингера, 1961). Азиды можно получать и непосредственно из НООС-производных с помощью дифенилфосфорилазида N3PO(OC6H5)2, применяемого в качестве конденсирующего агента (в частности, для получения циклопептидов).

Метод смешанных ангидридов. Симметричные ангидриды ациламинокислот легко получаются обработкой последних дициклогексил-карбодиимидом (ДСС) или этоксиацетиленом.

Более распространенным является метод смешанных ангидридов, который в последнее время широко используется в твердофазном синтезе. Быстрый ступенчатый метод синтеза пептидов с использованием избытка смешанных ангидридов носит название REMA-синтеза. К этой группе методов можно отнести и синтез пептидов с применением в качестве конденсирующего средства 1-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолина.

Метод активированных эфиров. Среди арильных активированных эфиров наиболее широко используются п-нитрофениловые (–ONp), 2,4-динитрофениловые, о-нитрофениловые и о-нитротиофениловые, 2,4,5-трихлорфениловые (–ОТср), пентахлорфениловые (–ОРср). Особое значение приобрели предложенные Л. Кишфалуди высокореакционноспособные пентафторфениловые эфиры (–OPfp). Ариловые эфиры этих типов получаются обычно из соответствующих фенолов с помощью карбодиимида.

В последние годы большое распространение получили активированные эфиры на основе производных гидроксиламина, прежде всего N-гидроксисукцинимидные эфиры.

Карбодиимидный метод.Дициклогексилкарбодиимид предложен в 1955 г. Дж. Шиэном и Г. Хессом при синтезе пенициллина. Первой стадией реакции является активирование карбоксильного компонента путем образования реакционноспособного производного О-ацилизомочевины.

Производное О-ацилизомочевины превращается в пептид непосредственно или через соответствующий симметричный ангидрид. Главным побочным процессом является О → N-ацильный сдвиг, приводящий к получению нереакционноспособных побочных продуктов – N-ацилизомочевин.

Карбоксиангидридный метод.В 1966 г. Р. Хиршман предложил использовать для направленного синтеза пептидов в водной среде N-карбоксиангидриды (NCA, ангидриды Лейкса, оксазолидиндионы). Суть предложенного им приема заключается в точном регулировании рН среды: конденсация N-карбоксиангидрида с аминокислотой проводится при рН 10,2, при подкислении осуществляется N-декарбоксилирование производных карбаминовой кислоты, и затем цикл реакций повторяется (иногда такой прием обозначается как «рН-весы»). Этим методом, в котором построение цепи ведется от С- к N-концу, Р. Хиршман получил весьма длинные пептидные фрагменты S-белка рибонуклеазы. Рацемизация, т. е. полная или частичная потеря оптической чистоты одного или более аминокислотных остатков, является главной побочной реакцией в пептидном синтезе, накладывающей жесткие ограничения на выбор защитных групп и методов конденсации. Рацемизация приводит к образованию оптически неоднородных продуктов, разделение которых по мере удлинения цепи резко осложняется и превращается в практически не осуществимую задачу.

Синтез на полимерном носителе.Пептидный синтез в классическом варианте сопряжен со значительными затратами труда и времени. С целью создания более эффективной методологии Р. Меррифилд в 1963 г. предложил твердофазный метод синтеза пептидов. Идея его состоит в закреплении растущей полипептидной цепи на полимерном нерастворимом носителе. При этом значительно упрощаются операции выделения промежуточных продуктов, которые сводятся к экстракции и фильтрованию полимера, полностью снимается проблема нерастворимости пептидов и создаются предпосылки для автоматизации процесса. Определяющим фактором в твердофазном синтезе является полнота протекания всех химических реакций, которая достигается за счет применения избытка конденсирующего агента и N-защищенной аминокислоты, отделяемых экстракцией. Естественно, выбор защитных группировок и методов конденсации должен обеспечить полное отсутствие рацемизации. Наилучшие результаты достигаются при использовании Вое-, Врос- и Fmoc-защитных групп, методов симметричных ангидридов и дициклогексилкарбодиимидного. Успешное проведение синтеза на твердом полимере требует применения высокоочищенных реагентов и растворителей на всех стадиях процесса. Первый твердофазный синтез гормона брадикинина был проведен Р. Меррифилдом с общим выходом 70%. В качестве носителя наиболее широко используется микропористый хлорметилированный сополимер стирола и дивинилбензола, хорошо набухающий в органических растворителях и обладающий химической и механической прочностью.

Полусинтез пептидов и белков. Полусинтез (семисинтез, частичный синтез) – способ получения соединений, заключающийся в комбинировании природных пептидов и белков или их фрагментов с пептидами, полученными полным синтезом или модификацией природных объектов. Полусинтез можно рассматривать как методический прием, основанный на модификации природных соединений. Известные в структурной химии белка способы ферментативного и химического расщепления пептидной цепи и разделение образующихся в результате фрагментов с помощью хроматографической техники позволяют получать гомогенные пептидные блоки. С помощью различных методов можно осуществить целенаправленное изменение нужного фрагмента (укорочение, удлинение, введение новых остатков и т. п.) и затем собрать из блоков новые, видоизмененные последовательности. Защитные группы при полусинтезе выбираются таким образом, чтобы их введение сохраняло способность производных растворяться в водных и водно-органических растворах. При сборке нужной последовательности из подготовленных пептидных блоков чаще всего используются такие методы, как DCC/HOBt, DCC/HOSu, а также азидный метод и метод активированных эфиров. Особое внимание уделяется при этом проблеме рацемизации.

Синтез циклопептидов.Для получения циклических пептидов используются обычные для пептидного синтеза методы создания амидной связи. Чаще всего первоначально создается линейный предшественник в виде защищенного пептида, активируется С-концевая карбоксильная группа, освобождается N-концевая аминогруппа и проводится реакция аминолиза собственной аминогруппой пептида. Для уменьшения межмолекулярных реакций аминолиза, приводящих к полимеризации и вследствие этого циклоолигомеризации, реакции циклизации проводят в условиях высокого разбавления в инертных растворителях. Однако, как правило, побочные реакции полимеризации всегда имеют место и уменьшают выход циклического продукта. Лучшие результаты дает метод получения циклопептидов на полимерном носителе.