Лекция 9. флуоресцентная спектроскопия Интенсивность поглощения света единицей объема вещества связана с экспериментально измеренными величинами известной формулой Ламберта-Бэра - Лекция, раздел Химия, Лекция 9. Флуоресцентная Спектроскопия...
|
Лекция 9. флуоресцентная спектроскопия
Люминисценцией является излучение фотонов электронно-возбужденными состояниями молекул. Она состоит из 2-х видов: флуоресценции и фосфоресценции. Отдельно находится так называемая биолюминесценция или хемолюминесценция, которая происходит не за счет поглощения света, а обеспечивается химической реакцией. Явление биолюминесценции широко распространено в различных биологических организмах; например, в медузах и светлячках. Основным компонентом, осуществляющим свечение этих организмов, является белок – люцефераза со связанным с ним ко-фактором – целентеразином. В биомакромолекулах люминесценция обеспечивается либо собственными хромофорами либо присоединенными к ним ковалентно или сорбированными флуоресцентными метками. В белках существуют три вида аминокислотных остатков, которые способны излучать свет после его поглощения. К ним относятся триптофан, тирозин и фенилаланин. Параметры люминесценции позволяют установить локализацию этих ароматических остатков в белках и охарактеризовать свойства их окружения.
В настоящее время метод собственной люминесценции широко используется в биофизике и биохимии благодаря относительной простоте измерения и использованию низких концентраций люминесцирующих объектов. Люминесценция происходит в результате электронного перехода возбужденной поглощением фотона света молекулы хромофора в основное невозбужденное состояние. Это явление можно пояснить следующей условной схемой уровней энергии, называемой схемой Яблонского.
|
|
|
|
|
|
|
Интенсивность поглощения света единицей объема вещества связана с экспериментально измеренными величинами известной формулой Ламберта-Бэра
Iпогл. = I0 exp(-e × l × c),
Где I0 – начальная интенсивность падающего света, e – молекулярный коэффициент поглощения при данной частоте n, l – длина пути света в поглощающем веществе, с – концентрация молекул поглощающего вещества.
Поглощение кванта света, в зависимости от его энергии, переводит молекулу из основного состояния S0 на один из колебательных уровней возбужденных состояний S1, S2 и т.д. В концентрированной среде энергия возбуждения состояния S2 или любого другого высокого состояния (выше S1), быстро диссипирует благодаря неупругим столкновениям и молекула безызлучательно достигает нулевого колебательного уровня состояния S1. Безызлучательные переходы между электронными состояниями одной и той же мультиплетности называются внутренней конверсией. При этом энергия возбуждения переносится во внешнюю среду. Безызлучательная дезактивация S1 Þ S0 происходит по такому же механизму. Излучательные переходы в молекуле между синглетными уровнями приводят к появлению флуоресценции. Сравнение процессов флуоресценции S0 ¬ S1 и поглощения S0 ® S1 показывает, что наиболее длинноволновая линия поглощения совпадает по энергии с наиболее коротковолновой линией излучения. Эта линия называется О – О линией.
Основные принципы флуоресценции
Nf = I0(1 – 10-D)qf
где I0 – интенсивность падающего света; D – оптическая плотность раствора; qf – квантовый выход флуоресценции, который определяется как отношение числа квантов, излучаемых из возбужденного состояния, к числу квантов, поглощаемых при переходах из основного в это возбужденное состояние в единицу времени.
Время жизни люминесценции
Время жизни t возбужденного состояния определяется как время, требуемое для уменьшения начального числа возбужденных состояний в «е» раз. Собственное время жизни, t0, возбужденного состояния – это среднее время жизни этого состояния в отсутствие безызлучательных процессов дезактивации.
где qf – квантовый выход, – собственное время жизни, а tf – измеряемое время жизни. При непрерывном облучении раствора в течении периода времени, более длительного, чем время жизни флуоресценции, система достигает стационарного состояния, когда скорость образования синглетных возбужденных молекул S1, будет равна скорости их исчезновения в ходе различных процессов дезактивации.
Применения измерений анизотропии в биохимии
Измерение анизотропии флуоресценции широко используется в биохимических исследованиях. Это происходит потому, что любые факторы, которые влияют на размер, форму и сегментальную гибкость макромолекулы, будут влиять на наблюдаемую анизотропию. Вышеперечисленные свойства макромолекул могут изменяться под воздействием рН, температуры, вязкости, денатурирующих агентов и из-за реакций ассоциации. В следующих разделах будет приведен ряд результатов, которые иллюстрируют использование и интерпретацию измерений анизотропии.
РИС. 5.10. Схема отбора плоскостных и внеплоскостных вращений путем выбора r0 или длины волны возбуждения на примере перилена.
Денатурация DNA
В качестве заключительного примера использования метода поляризации приведен температурный график Перрена для комплекса профлавин — DNA [24] (рис. 5.16). Профлавин встраивается между парами оснований двойной спирали DNA. При такой локализации его вращательное движение строго ограничено. Наблюдаемое значение поляризации ~0,36 при Р0 = 0,474 показывает, что профлавин практически неподвижен, когда он связан с DNA. Наиболее отличительной чертой этих данных является резкое увеличение 1/Р — 1/3, наблюдаемое при 60 °С, которое вызвано термической денатурацией DNA, сопровождающейся высвобождением связанного профлавина.
– Конец работы –
Используемые теги: Лекция, флуоресцентная, спектроскопия, Интенсивность, поглощения, света, единицей, объема, вещества, связана, экспериментально, измеренными, величинами, известной, формулой, Ламберта-Бэра0.183
Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Лекция 9. флуоресцентная спектроскопия Интенсивность поглощения света единицей объема вещества связана с экспериментально измеренными величинами известной формулой Ламберта-Бэра
Если этот материал оказался полезным для Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:
Твитнуть |
Новости и инфо для студентов