При возбуждении поляризованным светом испускание флуоресцирующего образца также поляризовано. Поляризация является результатом фотоотбора флуорофоров в соответствии с их ориентацией по отношению к направлению поляризованного возбуждения. Испускание может быть деполяризовано по ряду причин, относительная важность которых зависит от исследуемого образца. Вращательная диффузия флуорофоров – одна из общих причин деполяризации. Измерения поляризации или анизотропии выявляют среднее угловое смещение флуорофора, которое происходит между поглощением и последующим испусканием фотона. Оно зависит от скорости и степени вращательной диффузии за время жизни возбужденного состояния. Диффузионные движения в свою очередь зависят от вязкости растворителя и размеров и формы диффундирующих частиц. Например, для флуорофора, находящегося в растворе, скорость вращения зависит от вязкого сцепления, накладываемого на флуорофор растворителем. В результате изменение вязкости растворителя будет приводить к изменению анизотропии флуоресценции. Обнаружение зависимости анизотропии флуоресценции от вращательной диффузии привело к многочисленным применениям этого метода в биохимических исследованиях. В качестве примера отметим, что измерение анизотропии флуоресценции использовалось для количественной оценки денатурации и реакций ассоциации белков с лигандами, изучения скорости вращения белков. Кроме того, на основе анизотропии мембранно-связанных флуорофоров были установлены внутренняя вязкость мембран и влияние состава мембран на их фазовые переходы.