Анализ параметров клеточного цикла

Анализ параметров клеточного цикла. Благодаря фундаментальным исследованиям в области экспериментальной биологии и клинической медицины были получены факты, касающиеся кинетики клеточного цикла.

К настоящему времени уже накоплен определенный опыт работы по данному вопросу. Практически не существует ни одного органа или ткани человеческого организма, экспериментального животного, который бы не подвергался цитометрическому или цитоспектрофотометрическому анализу. На основании этих данных установлено, что содержание ДНК нормальных соматических клеток соответствует диплоидному набору хромосом 2с и характеризуется одним модальным классом на ДНК-гистограмме.

Значение этого параметра для одного и того же индивида может колебаться в пределах 30. Наиболее выраженные вариации в содержании ДНК наблюдаются в клетках пролиферирующих органов печени и селезенки. Эти данные были получены при определении содержания ДНК в ядрах клеток различных органов и тканей фенотически здоровых людей 130 проб по 5 14 от каждого случаяE.Muller, R.Weidhase, 1983. В изучаемых объектах схематически представлены фазы митотического цикла и распределение ДНК в различных тканях.

Рассчитывалась кинетика клеточной пролиферации, а в патологически измененном органе степень выраженности процесса, особенно в случае раковой опухоли. Благодаря использованию в исследованиях сканирующих и проточных цитофотометров определены важные данные, касающиеся классификации клеток по фазам митотического цикла, а также получены результаты, позволяющие оценить продолжительность и дисперсию соответствующих фаз цикла G1, S, G2M. Однопараметрический анализ кинетики клеточного цикла по изучению содержания ДНК показал возможности количественной цитометрии и открыл широкие перспективы относительно его использования для исследования и углубления знаний по изучаемому вопросу.

В настоящее время появились данные, которые значительно расширяют традиционное представление, касающееся распределения клеток в четырех последовательных фазах цикла.

Одновременное изучение двух параметров ДНК и белка, ДНК и РНК дает существенно больше информации о кинетике клеточного цикла, так как позволяет разделить сливающиеся фазы цикла, такие, как G0 G1, G2M, а также идентифицировать дополнительные фазы в пресинтетическом G1 и постсинтетическом G2 периодах. При анализе пресинтетического периода в эксперименте и клиническом материале была показана возможность использования АО ДНК и РНК для дополнительной классификации G1-периода на GIQ, GIA, GIB и G2A, G2B Z.Darzynkiewicz, F.Traganos, M.R. Melamed, 1980. На культуре клеток Hela с использованием меченых радиоактивных изотопов и проточной цитометрии выделены в постсинтетическом периоде клетки, относящиеся к ранней G2A и поздней G2B фазам клеточного цикла O.C.Blair, R.T.Winward, J.L.Roti, 1979. Pollack и др. A.Pollac, H.Moulis, N.L.Block, G.L.Irvin, 1984 при цитометрическом анализе ДНК и белка FITCPI в клетках трех различных экспериментальных моделей, включающих культуру лейкозных опухолевых клеток крыс FL4, микрокультуру лимфоцитов периферической крови человека HPBL, не стимулированных и стимулированных фитогемагглютинином ФГА, а также материала солидной опухоли в виде перевивной аденокарциномы предстательной железы крыс R 3327Q показал возможность разделения пресинтетического периода на три фазы, выделив в нем покоящиеся клетки GIQ, ранние GIA и поздние G2B клетки, в постсинтетическом периоде были соответственно выделены ранние G2А и поздние G2B клетки.

Для задержки вхождения клеток в S-фазу использовали актиномицидин D, оксимочевину, для блока митотических клеток применяли колцемид.

В работе также представлены данные, свидетельствующие о возможности классификации пролиферирующих лимфоидных и лейкозных опухолевых EL4-клеток в различные сроки культивирования на соответствующие S-фазы клеточного цикла с раздельным выделением в них M- и G2-фаз. Исходя из представленных данных, очевидно, что проточный цитометрический анализ по двум параметрам является одним из перспективных методов оценки кинетики клеточного цикла, позволяющий провести идентификацию клеток, находящихся в ранее неопределяемых фазах цикла G1A, G1B и G2A, G2B, и определить клетки, находящиеся в фазах M и G2. В некоторых работах клинического направления используется двухпараметрический анализ клеточного материала с достаточно успешной классификацией патологических процессов, например при распознавании доброкачественных и раковых процессов мочевого пузыря, шейки матки, а также для классификации различных форм гемобластозов.

В современной литературе весьма широко представлены данные по цитоспектрофотометрическому изучению интерфазных ядер. Следует отметить, что особую ценность представляют работы, направленные на изучение митотических клеток с последующим анализом хромосом.

Известно, что изменения, регистрируемые в хромосомах, могут быть определяющими диагностическими маркерами опухоли, особенно на начальных этапах возникновения злокачественного процесса.

Однако используемые методы анализа хромосомного материала сравнительно сложны и трудоемки.

Поэтому в последнее время наряду с обычными цитогенетическими методами исследования кариотипа нормальных и малигнизированных клеток стали применяться сканирующие и проточные цитометрические анализаторы. Приборы последнего типа обеспечивают достаточно высокую точность и скорость измерения, а также воспроизводимость результатов.

Скорость анализа хромосом в протоке составляет 1000 2000 хромосом в секунду. Проточный цитометрический анализ ДНК метафазных хромосом в суспензии является совершенно новым методом кариотипирования. Поэтому в исследованиях такого рода основной акцент делается на разработке эффективных методов сепарации интактных хромосом с сохранением их целостности и морфологической структуры. В представленных работах чаще всего изучаемой моделью являются метафазные хромосомы, полученные из клеток китайского хомячка и человека, приготовленные для прямого кариотипирования, а также для анализа кариотипа с кратковременным или длительным культивированием клеток.

Для анализа генетического материала используются однопараметрические проточные системы, где проводится анализ и сортировка хромосом по интенсивности флуоресценции в комплексе с такими флуорохромами, как PI, EtBr, Ho 33258, а также применяются высокоразрешающие проточные цитометры с двухлазерной системой, которые обеспечивают бивариантный анализ ДНК, меченный двумя флуорохромами.

Большей частью используют сочетание Но 33258, специфически связывающийся с АТ-богатыми участками ДНК, и хромомицин А3, селективно взаимодействующий с ГЦ-парами. Данные, полученные при помощи автоматизированных систем, представляются в виде гистограмм, так называемых проточных кариограмм. О качестве анализа свидетельствует высокое разрешение гистограмм, Которые характеризуются множественными узкими пиками, относящимися к различным классам хромосом.

Количество пиков в большинстве случаев соответствует набору хромосом, которое характерно для данного индивидуума. При исследовании клеток зародыша китайского хомячка методом проточного кариотипирования на этапе экспоненциального роста были получены все 11 пиков, соответствующие 11 парам хромосом самки, исследуемого животного J.A.Steinkamp, 1984. Обычно применяемые цитогенетические методы не позволяют идентифицировать Y-хромосому из G- и F-групп хромосом человека.

Применение проточной цитометрии позволяет решить эту задачу. Так, на лимфоцитах, выделенных из периферической крови доноров-мужчин, с кратковременным культивированием 52 ч и добавлентем колцемида была показана возможность определения позиции Y-хромосомы по интенсивности ДНК-флуоресценции Но 33258 в виде пика на проточной кариограмме. У 17 обследуемых доноров позиция Y-хромосомы на гистограмме варьировала. В некоторых наблюдениях пик Y-хромосомы находился между 19 и 20 хромосомами, в других между 20-й и 17-й. В 70 случаев Y-хромосома была контаминирована с 20-й. Из работ, посвященных хромосомному анализу, известно, что при использовании однолазерной проточной системы может быть идентифицировано около 15 хромосом человека, исключая Y-хромосому.

Применение двухлазерной системы FACS-11 позволяет по интенсивности флуоресценции распознать около 20 популяций хромосом в метафазных пластинках и, что особенно ценно, идентифицировать маленькие аутосомы человека M.Lalande, R.R.Schreck, R.Hoffman, S.A. Latt, 1985. В этом случае помимо флюорохромов Но 33258 и хромомицина А3 в комплекс субстрат-флюорохром вводится третий краситель нетропсин или дистамицин А. Это способствует получению дополнительной информации о специфике хромосом, т.е. определению структурных особенностей нормальных и атипических хромосом.

В результате бивариантного проточного анализа с дополнительной окраской хромосом авторам удалось на модели клеточной линии человеческих лимфобластов получить высокое разрешение метафазных пластин с последующим изучением структурной перестройки хромосом и идентификацией аномальных.

Проточный бивариантный анализ, используемый для кариотипа хромосом, апробирован на достаточно широком спектре клинического и экспериментального материала, включая опухоль прямой кишки, культуры клеток асцитической жидкости, лимфоцитов периферической крови и фибробластов человека V.G.Enchev, K.G.Tsanev, 1985. 4.Наиболее употребительные методики, используемые в цитометрии клеточного цикла.

При проточной цитометрии можно сканировать от 100 до нескольких тысяч клеток в секунду, что позволяет очень быстро получить достоверные результаты. Однако таким способом можно анализировать только очень разбавленные клеточные суспензии. Солидные ткани необходимо сначала дезагрегировать, что всегда сопровождается нарушением морфологии. Клетки монослоя обычно диспергируют обработкой трипсином в присутсвии ЭДТА. Дезагрегация свежих солидных опухолей Методы дезагрегации клеток можно подразделить на три группы методы, основанные исключительно на механической обработке ферментативные методы методы выделения ядер Самые простые и быстрые методы дезагрегации включают только механическую обработку тканей.

Эти методы особенно хороши для рыхлых тканей например, лимфатических узлов и позволяет получать густые суспензии клеток за несколько минут. Для получения неочищенных клеточных суспензий можно использовать аспираты солидных опухолей, взятые с помощью шприца. Ферментативный метод позволяет получить достаточно концентрированную клеточную суспензию из разнообразных опухолей, но при больших затратах времени.

Для выделения ядер обычно из тканей, частично дезагрегированных механическим путем разработаны различные методы, основанные на использовании ферментов, детергентов или тех и других. Детальная процедура дезагрегации тканей, окрашивания препаратов, получения результатов и их анализа для суспензии ядер разработана Винделовом и др. L.L.Vindelov, I.J.Christensen, 1990. Цель дезагрегации состоит в получении с высоким выходом суспензии интактных изолированных клеток или ядер, достаточно хорошо соответствующей исходному образцу ткани.

Выбор способа дезагрегации зависит от типа ткани, размеров препарата, целей исследования, а иногда от быстроты и стоимости метода. Суспендирование архивных препаратов, залитых в парафин Методика исследования ДНК с помощью проточной цитометрии суспензии ядер, полученной из заключенных в парафин архивных препаратов, была впервые описана в 1983 г. D.W.Hedley, M.L.Friedlander, I.W.Taylor, 1983. Эту методику можно использовать в модифицированном виде для анализа самых разнообразных опухолей.

Это дает целый ряд преимуществ можно проводить обширные ретроспективные клинические исследования значительно упрощается изучение редко встречающихся патологий парафиновые срезы легко транспортировать, что позволяет проводить цитометрические исследования в специальных центрах. Недостатки метода состоят в том, что качество получаемых результатов, как правило, не очень высокое нельзя использовать внутренний ДНК-стандарт.

Качество результатов можно повысить, если немного усовершенствовать фиксацию тканей C.E.Gillett, R.S.Camplejohn, S.M.OReily, 1990. Хороший эффект дает фиксация в формалине при нейтральном рН при 4С в течение ночи. Следует избегать нагревания ткани если только оно не является абсолютно необходимым при ее обработке или неоправданно длительной фиксации. Окрашивание ДНК При окрашивании клеточной ДНК с целью последующего определения ее содержания с помощью проточной цитометрии следует учитывать специфичность красителя по отношению к ДНК его спектральные характеристики интенсивность флуоресценции и возможность ее регистрации имеющимися в продаже приборами стоимость и удобство в работе растворимость, стабильность и т.д. Этим требованиям отвечает целый ряд флуорохромов.

Детальное их описание дано в работах Waggoner A.S. 1990, Crissman H.A Steincamp J.A. 1990, Laff S.A Langolis R.J. 1990. В проточной цитометрии для окрашивания ДНК чаще других флуорохромов используется иодистый пропидий ИП даже несмотря на то, что он не строго специфичен по отношению к ДНК. С помощью ИП можно окрашивать также двухцепочечную РНК. Спектральные характеристики ИП очень удобны для проточной цитометрии для возбуждения флуоресценции используется обычный аргоновый лазер с рабочей длиной волны 488 нм, а максимум флуоресценции находится вблизи 620 нм, что позволяет параллельно использовать флуоресцеин при проведении многопараметрических измерений.

Независимо от красителя последний должен находиться с ДНК в стехиометрических соотношениях, т.е. количество связанного с ДНК красителя должно быть пропорционально содержанию ДНК в клетке.

Чтобы красителем были заняты все доступные для связывания места, его следует брать в некотором избытке. Большинство флуоресцирующих красителей, связывающихся с ДНК, в том числе и ИП, не могут проходить через мембраны интактных клеток. Чтобы повысить проницаемость мембран, клетки либо фиксируют спиртом, либо обрабатывают детергентами.

Использование другой ДНК в качестве стандарта. Содержание ДНК, которой отвечает один из пиков на ДНК-гистограмме для исследуемого препарата, можно оценить, сравнив этот пик с пиком для другой ДНК, содержание которой известно. Так, сравнение левого пика на рис.1 с пиком, отвечающим ДНК диплоидных лимфоцитов периферической крови человека, говорит о том, что мы имеем дело с диплоидными клетками.

В докладе Комитета по номенклатуре в аналитической цитометрии рекомендуется использовать лимфоциты в качестве независимого стандарта ДНК. Известны и другие случаи, когда стандартом служат ядерные эритроциты не млекопитающих, а других животных. Если используются ядра, выделенные из заключенных в парафин препаратов, то независимые ДНК-стандарты применять нельзя. Это связано с неодинаковым окрашиванием ДНК в ядрах, выделенных из разных парафиновых блоков, вследствие различий в процедурах фиксации и обработки тканей.

Если на ДНК-гистограммах препаратов, заключенных в парафин, наблюдается два G1-пика, то левый из них условно считается соответствующим диплоидным клеткам рис.1, Б. Это не мешает выявлению анеуплоидных клеток, поскольку все образцы содержат внутренний контроль диплоидные клетки лимфоциты, эндотелиальные клетки и т. д Но в результате некоторые образцы ошибочно классифицируются как гиперплоидные, хотя на самом деле являются гипоплоидными. Клиническая значимость такой неправильной классификации неизвестна, но в любом случае ее вероятность невелика. 5.