Применение цитометрии в молекулярной клинической диагностике

Применение цитометрии в молекулярной клинической диагностике.

На первых порах основным стимулом к развитию проточной цитометрии послужило желание автоматизировать цитологические методы, использующиеся для диагноза заболеваний, но большинство опубликованных к настоящему времени работ посвящено применению этого метода для прогностических целей. Интенсивное развитие автоматизированных диагностических систем сканирующего и проточного типов способствовало быстрейшему внедрению цитометрического метода исследования в клиническую практику.

В процессе развития и освоения метода происходит его специализация по трем ведущим направлениям. Первое это массовые профилактические осмотры населения с целью выявления ранних стадий заболевания, второе дифференциальная диагностика пограничных состояний и злокачественного роста, третье контроль динамики опухолевого заболевания в ходе проведения лекарственной, лучевой и комбинированной терапии, а также хирургического метода лечения.

Особенно плодотворно ведутся цитометрические исследования в области гематологии, гинекологии, урологии, пульмонологии, гастроэнтерологии, метод также используется для диагностики патологических процессов молочной и щитовидной желез. Из истории количественной цитометрии известно, что одним из первых объектов изучения были форменные элементы крови и эпителиальные клетки слизистой оболочки шейки матки.

Данное обстоятельство связано с доступностью получения диагностического материала, разнообразием клеточных элементов, характеризующих нормальное физиологическое состояние исследуемых объектов, а также с трудностью морфологической идентификации их при различных патологических процессах, особенно онкологических заболеваниях. Гинекология Достаточно большой опыт применения количественной цитометрии в области гинекологии позволяет выделить несколько этапов в развитии количественного метода оценки морфологических особенностей эпителиальных клеток шейки матки.

Первый этап характеризуется исследованиями, в которых рассматривается возможность осуществления цитоскрининга, т.е. разграничение патологических процессов на две группы норма рак. Второй этап связан с дифференциацией пограничных состояний шейки матки по анализу одного, двух критериев диагностики с последующим применением корреляционного анализа, построением двух- и трехпараметрических диаграмм зависимостей изучаемых признаков.

Третий этап исследований направлен на углубленную идентификацию клеток с изучением их структурных особенностей интегральная оптическая плотность, содержание ДНК, отражающих определенные состояния шейки матки при диспластических, метапластических процессах, внутриэпителиальном и инвазивных формах рака. Полученные результаты могут послужить основой изучения механизмов перестройки эпителиального пласта в процессе его озлокачествления и определения природы злокачественной трансформации клетки.

Характеризуя данное направление, можно подчеркнуть значимость цитометрических исследований и в области осуществления контроля качества цитологической и гистологической диагностики заболеваний шейки матки, а также оценки степени репарации ткани в процессе лечения. Исходя из фундаментальных исследований, посвященных оценке более чем 196 качественных и количественных признаков ядра и клетки и общего фона препарата, определяют, что более значимы параметры, характеризующие морфологические особенности ядра Б.М.Брамберга, И.Я.Зитаре, Д.П.Плегере, Э.Х.Смилтниекс,1970. Поэтому при количественном анализе препаратов обычно исходят из информативности размерных и структурных характеристик ядра изучают его площадь, периметр, объем, диаметр, определяют коэффициент формы и оптическую плотность, содержание ДНК, РНК и белка в нем. На основании данных проточной цитометрии установлено, что среди обследуемых пациентов с различной патологией шейки матки в 74,5 случаев имеются кондиломатозные изменения.

Установлен профиль типичной ДНК-гистограммы для данной патологии шейки матки с высоким содержанием ДНК в G0G1-фазе и ранней S-фазе клеточного цикла.

Полагают, что наблюдаемые изменения в ДНК-гистограмме можно рассматривать как проявление папилломо-вирусной инфекции в этиологии кондиломы шейки матки K.C.Tsou, D.H.Hong, M.Varello et al, 1984. Кроветворная система При цитометрическом анализе клеточных элементов крови используют критерии, которые включают довольно широкий спектр параметров.

Это в первую очередь цитометрические маркеры с использованием специфических красителей на РНК, ДНК, различных ферментативных систем эстеразу, фосфатазу. Используются также размерные критерии, которые включают объем, площадь, периметр и диаметр ядра и цитоплазмы клеток, а также ядерно-цитоплазматическое отношение. При исследовании диагностического материала при острых и хронических формах лейкозов методами цитометрии обнаружены некоторые различия для клеточных элементов той или иной группы гемобластозов.

Используя морфометрические методы оценки размерных признаков ядра и цитоплазмы бластных клеток, обнаружена строгая корреляция величины клеток и FAB франко-американо-британской- классификации лейкозов. При сопоставлении количественных данных, полученных при исследовании клеточных элементов при острых лимфобластном и миелобластном лейкозах, классифицируемых по морфологическим признакам на подгруппы М1 М6 согласно FAB-классификации, определены различия между двумя вариантами лейкозов, кроме подгруппы М2. Регистрируемые различия в размере бластных клеток связаны с фазами клеточного цикла.

Установлено, что клетки при остром миелобластном лейкозе в S-фазе цикла характеризуются большим размером ядра. Для этой же форме лейкоза, но подгруппы М1 характерна более малая доля клеток в S-фазе клеточного цикла M.Efrench, P.A.Bryon, D.Fiere et al, 1981. Молочная железа С целью повышения диагностических возможностей цитологического метода при добро- и злокачественных опухолях молочной железы, определения их гистологических вариантов, разработки прогностических критериев заболевания также используются данные морфометрии и цитоспектрофотометрии.

При объективизации цитологических препаратов исходя из информативности следующих признаков диаметр, периметр и площадь ядра и цитоплазмы, ядерно-цитоплазматическое отношение, текстура хроматина, содержание ДНК и РНК. На основании цитометрических исследований установлены некоторые закономерности, характерные для злокачественных форм опухолей молочной железы. Это вариабельность ядерно-цитоплазматического отношения, нарастание размера ядра и содержания ДНК. Между двумя последними показателями обнаружена корреляционная зависимость, характеризующаяся следующими особенностями.

Показано, что клетки с некоторой атипией, которая выражается в увеличении площади ядра, распределяются различно по фазам клеточного цикла. Около 21 клеток, находящихся в области 4с ДНК-гистограммы, имеют площадь ядер свыше 125 мкм2. При площади ядер от 50 до 100 мкм2 основная масса клеток находится в G1-фазе цикла и только около 5 клеток приходятся на гипердиплоидную область распределения ДНК C.J.Cornelisse, A.J.Van Driel-Kulker, F.Meyer, J.S.Ploem, 1985. Показатель ДНК количество ДНК в 1 клетке опухоли на количество ДНК в нормальной клетке в различных типах злокачественных опухолей молочной железы значительно варьирует, однако чаще наблюдается тетраплоидия 60 80, доброкачественные опухоли, как правило, диплоидные.

Сравнительная оценка содержания ДНК в клетках молочной железы при доброкачественных и раковых процессах показала определенную зависимость между соотношением клеток по фазам цикла.

Установлено, что с прогрессированием процесса количество диплоидных клеток в G1-фазе цикла убывает и при III IV стадии ракового процесса составляет 64. Количество тетраплоидных клеток нарастает в 2 раза и составляет около 17 общего количества клеток по сравнению с пролиферативной формой мастопатии и в 3 раза по отношению к непролиферативной форме мастопатии.