Суспензионное культивирование клеток

Суспензионное культивирование клеток. В 1953 году Оуенс с сотрудниками впервые показал способность клеток размножаться в жидкой среде в свободно суспендированном состоянии.

С тех пор метод суспензионного культивирования привлекает внимание исследователей в связи с его высокой эффективностью при накоплении больших количеств клеток. Оказалось, что клетки перевиваемых линий, в отличие от остальных типов клеточных культур, могут длительно культивироваться во взвешенном состоянии. Клетки в этих условиях размножаются, не прикрепляясь к стенкам культурального сосуда, находясь в суспензионном состоянии, благодаря постоянному перемешиванию среды.

При оптимальном режиме выращивания клетки в суспензиях быстро размножаются, имеют более высокий урожай, чем в стационарных культурах. Первичные и перевиваемые линии клеток имеют неодинаковую способность роста в суспензии. Так, гетероплоидные и анеуплоидные постоянные линии, в отличие от псевдодиплоидных линий, адаптируются быстрее к росту в суспензии.

Суспензионные культуры готовят из однослойных культур. Клетки отслаивают от стекла с помощью растворов версена и трипсина. Осадок клеток после центрифугирования 1000 обмин. ресуспендируют в свежей питательной среде. Приготовленную суспензию помещают в культуральные сосуды реакторы, ферментеры и выращивают при постоянном перемешивании. В научных исследованиях концентрация клеток в исходной суспензии колеблется от 0,3 до 10х10 в 1 мл. Оптимальная концентрация клеток в исходной суспензии должна быть 2-5х10 в 1 мл. По мнению Эрла и его сотрудников, концентрация клеток в суспензированной культуре должна быть такой, чтобы фаза логарифмического роста наступала не позднее 16-24 часов после приготовления культуры.

Суспензионные клеточные культуры проходят характерные стадии лаг-фазу, фазу логарифмического роста, стационарную фазу и фазу логарифмического отмирания. В первой стадии, как правило, количество клеток уменьшается, во второй стадии популяция клеток увеличивается логарифмическая стадия роста, в третьей стадии увеличения количества клеток не наблюдается стационарная фаза. Если культивирование продолжить дальше, то обнаружится период уменьшения численности клеток-фаза логарифмического отмирания фаза разрушения.

Скорость размножения клеток в логарифмической фазе роста выражают временем генерации. Под временем генерации имеется в виду период, необходимый для удвоения популяции клеток в культуре. Для суспензионного выращивания клеток важным условием является перемешивание жидкости, которое должно быть непрерывным и достаточно интенсивным, чтобы поддерживать клетки во взвешенном состоянии, препятствовать их осаждению и прикреплению к стенкам сосуда и в то же время не вызывать их механического повреждения.

Перемешивание суспензионных культур проводят лопастными магнитными мешалками, а также круговыми качалками. В настоящее время широко применяют вращение флаконов и бутылей вокруг продольной оси 15-40 обмин. На магнитных мешалках скорость вращения составляет 100 200 обмин. Скорость перемешивания зависит от объема культуры малые объемы культуры требуют невысокой скорости, тогда как ее необходимо увеличить при больших объемах.

Для предотвращения оседания клеток на внутренней поверхности сосуда производят силиконирование. Силиконовое покрытие в силу своей гидрофобности препятствует прикреплению клеток к стенке сосуда. Внутренние стенки культурального сосуда смачивают 5 или 10-ным раствором силикона и после испарения растворителя бензолового, ацетонового сосуды выдерживают при 85С и 200 соответственно в течение 30 и 60 мин. После охлаждения сосуды наполняют горячей бидистиллированной водой и оставляют на 2 часа, затем их 3 раза ополаскивают бидистиллированной водой и высушивают при 100С. Сосуды стерилизуют в сушильном шкафу при 170С в течение 2 часов.

Максимальный рост клеток в суспензии наблюдают при рН 7,0-7,2. Питательные среды, применяемые для выращивания клеток в суспензии, не отличаются от сред, используемых для выращивания клеточных линий в однослойной культуре.

Чаще всего при культивировании клеток в суспензиях берут среду Игла с двукратной концентрацией аминокислот и витаминов. Суспензионные культуры потребляют в 2-7 раз больше глюкозы, чем монослойные. В процессе потребления глюкозы клетки выделяют в среду токсичную для них молочную кислоту. Потребление клетками глюкозы и выработка молочной кислоты идут параллельно и находятся в прямой зависимости от плотности клеточной популяции.

Полезным оказалось прибавление к питательной среде инсулина в количестве от 40 до 200 ЕД на 1 л. Прибавление к питательной среде инсулина изменяет соотношение между количеством поглощенной глюкозы и выделенной молочной кислоты. Для клеток линии L указанный коэффициент может быть снижен с 74-81 до 37-38. Различные аминокислоты потребляются из питательной среды растущими клетками с неодинаковой скоростью. Отмечено, что регулярное прибавление аргинина 20-40 мгл и увеличение количества глутамина до 450 мгл благоприятствуют росту взвешенных культур.

Прибавление инозитола 0,4 мгл позволяет ускорить рост культур амниотических клеток человека. Желательным является добавление к среде каталазы 1 мгл и тироксина 12 мгл. Большой интерес представляют работы, посвященные получению взвешенных культур клеток в синтетической среде, не содержащей сыворотки крови. Предпринимаются попытки увеличить вязкость питательной среды за счет безбелковых ингредиентов. С этой целью используется метил-целлюлоза и гиалуроновая кислота.

Метилцеллюлоза в концентрации 0,1-0,2 обладает максимальным защитным действием на взвешенные в среде клетки. Протективное действие метилцеллюлозы заключается в том, что молекулы образуют защитный слой вокруг клетки, предотвращающий повреждение клеток при перемешивании среды. Весьма важным показателем состояния суспензионной культуры является парциальное давление кислорода в жидкой фазе. Концентрация кислорода в газовой фазе зависит от плотности клеточной популяции и нередко бывает ниже атмосферной.

Недостаток кислорода ведет к появлению грануляции цитоплазмы, клетки теряют правильную округлую форму. При небольшом избытке кислорода клетки имеют хорошо очерченную, правильную, округлую форму, и становятся очень крупными при повреждающем действии избытка кислорода. Оптимальная концентрация кислорода для различных клеточных культур находится в пределах от 9 до 17 или 293 мм рт. столба. При концентрации кислорода выше 20 происходит ингибиция клеточного роста.

Так, при концентрации кислорода 24 размножение клеток почек эмбриона кролика линия ERK снижалось наполовину, а при 30 сводилось к нулю. Повышение концентрации кислорода токсически воздействует на клеточный метаболизм. Таким образом, размножение клеток в суспензии зависит от концентрации клеток в исходной суспензии, аэрации и рН среды, состава питательной среды, способа перемешивания, объема суспензии и других факторов. Однородность суспензии, возможность длительного поддержания клеток в логарифмической фазе роста, перспективы математического моделирования процессов клеточного роста в зависимости от влияния факторов внешней среды, удобство многократного исследования физиологического состояния культуры клеток в суспензии, высокая экономичность метода -вот далеко не полный перечень преимуществ суспензионных культур.

Суспензионные культуры широко используется в вирусологических исследованиях и для накопления больших количеств вируссодержащего материала, при изготовлении вакцин и диагностических препаратов. 3.5. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК НА МИКРОНОСИТЕЛЯХ. В 1967 г. Van Werel предложил метод культивирования, сочетающий элементы монослойного и суспензионного выращивания клеток, который он назвал методом микроносителей.

Суть его заключается в том, что клетки прикрепляются и размножаются на поверхности полимерных шариков-частиц микроносителей МН, которые содержатся в суспензии с помощью перемешивающего устройства, например мешалки. На одной частице МН диаметром 160 230 мм может поместиться 350-630 или в среднем 460 клеток. В одном мл среды можно суспензировать несколько тысяч частиц микроносителя, при этом общая площадь их составит от нескольких до 50 см2мл. Инокулированные в культиватор клетки прикрепляются к поверхности частиц МН и размножаясь, образуют сплошной монослой на каждой отдельной частице.

Основными преимуществами этого метода являются 1 создание равномерных условий по всему объему сосуда, что делает возможным эффективно контролировать необходимые параметры рН, р02 и др. 2 получение высокой плотности клеточной популяции до 5-6 млн. клеток в 1 мл 3 культивирование одновременно несколько сот миллиардов клеток 4 введение постоянного контроля за динамикой роста клеток 5 снижение роста контаминации в связи с сокращением операций, связанных с разгерметизацией культураль-ного сосуда 6 значительная экономии питательных сред 7 возможность сохранять выросшие клетки непосредственно на частицах при низких температурах 8 возможность искусственно создавать различные концентрации МН с выросшими на них клетками 9 возможность пассирования культуры без применения трипсина путем добавления свежих порций микроносителя.

Микроносители должны иметь - небольшой положительный заряд в пределах 1,5-1,8 МЭКВг. В связи с тем, что большинство клеток животных имеют слабо отрицательный заряд, они легче будут прикрепляться к такому МН - плотность 1,05 1,15 гсм указанная плотность является оптимальной для поддержания МН во взвешенном состоянии - диаметр частиц от 100 до 250 мкм, что обеспечивает площади для роста нескольких сотен клеток - гладкую поверхность - прозрачность - отсутствие токсичности компонентов для клеток - незначительное впитывание компонентов среды - универсальность, обеспечивающую возможность использования их для первичных, диплоидных и гетероплоидных клеток.

Немаловажное значение имеют свойства МН, которые позволяют использовать их многократно.

Проведено исследование многих гранулированных препаратов различной химической природы, в том числе из поперечно-сшитого ПС декстрана, ПС-агарозы, ПС-поливинилпиролидона, полиакрилнитрита, пористого селикагеля, полистирола, капрона, нейлона, алюмосиликата с целью использования их как микроносителей.

Пригодными являются только некоторые из них, главным образом имеющие в своей основе ПС-декстран. Несколько зарубежных фирм разработали коммерческие препараты микроносителей, готовые к употреблению Цитодекс-1, 2, 3 Франция, Швеция, Супербит США, Англия, Биосилон Дания. Стоимость перечисленных препаратов довольно высока, поэтому необходимо проводить исследования по разработке и производству отечественных МН. Культивирование клеток на микроносителях проводят в обычных ферментерах для суспензионного культивирования.

В ферментере не должно быть каких-либо выступов, карманов, чтобы предотвратить накопление микроносителей в застойных зонах. Поэтому разумно использовать ферментеры с круглым дном и гладкими стенками. Внутренняя поверхность ферментера должна быть силиконизирована для предотвращения прилипания микроносителей к стеклу или нержавеющей стали ферментера.

Для контроля за окружающими культуру условиями такими, как рН и О2, может быть использовано стандартное оборудование. Скорость перемешивания суспензии с носителем должна быть 40-60 обмин. Для выращивания на МН применяются различные типы клеток. Концентрация цитодекса может варьировать от 0,5 до 5 мгмл. Однако, при производстве профилактических вакцин, применяют обычно конечную концентрацию цитодекса, не превышающую 1 мгмл. Повышение концентрации до 3 мгмл и выше создает дополнительные трудности, связанные с необходимостью перфузии питательной среды и частичной ее замены, что осложняет технологический процесс.

Посевная концентрация клеток, а также условия культивирования на МН в первые часы в значительной степени определяют оптимальные параметры для пролиферации и максимального накопления клеток. Показано, что посев 10 клетокмл перевиваемой линии почек обезьян Vero и диплоидных клеток фибробластов эмбриона человека MRC-5 в уменьшенном до 13 объема питательной среды и при периодическом включении мешалки 30 обмин на одну минуту через каждый час в течение 4 часов, с последующим добавлением питательной среды до конечного объема, ведет к увеличению пролиферации клеток и их количества по сравнению с контролем полный объем питательной среды в момент посадки клеток и непрерывная работа мешалки с начала культивирования.

Важное значение для культивирования клеток на МН имеет питательная среда.

Правильный подбор питательной среды также будет способствовать оптимизации процесса пролиферации клеток и их качество. Необходимо проводить подбор питательных сред для культивирования клеток на различных типах МН. Показано, что перевиваемая линия клеток почек обезьян Vero на цитодексе дает наибольший выход при использовании среды Игла ДМЕ посадочная концентрация клеток 105 мл но сравнению со средой ВМЕ и 199. Если же количество клеток при посадке снизить до 104, то лучшие результаты дает среда 199. Все испытуемые среды содержали 10 фетальной сыворотки. 4.