Обнаружение вирусов. Обнаружить присутствие вирусов и определить их количество можно с помощью целого ряда различных тестов, например 1 Активность вируса измеряется путем определения количества содержащего вирус материала, необходимого для того, чтобы вызвать специфическую реакцию в организме хозяина.
Индуцируемая вирусом реакция может происходить по типу все или ничего т. е. наличие или отсутствие инфекции, а может быть выражена количественно, например продолжительностью времени, необходимого для проявления инфекции, или числом поражений в слое чувствительных клеток. Количественное определение вирусной активности называется титрованием.
Наименьшее количество вируса, способное вызвать соответствующую реакцию, называется инфекционной единицей, и титр исходной вирусной суспензии выражается числом инфекционных единиц, приходящихся на единицу объема.
Например, если минимальное количество суспензии вируса гриппа, вызывающее у мыши пневмонию при интраназальном введении суспензии ткани инфицированного легкого в разведении 1106 равно 0,1 мл, то это значит, что титр вируса гриппа в исходной суспензии ткани легкого равен 107 инфекционным единицам на 1мл 1101-10-6 107. Как правило, обязательным компонентом метода титрования вируса является тест, позволяющий оценить результат инокуляции как положительный или отрицательный.
Например, при титровании вирусов животных таким тестом может быть наличие или отсутствие видимых поражений в культуре клеток, воспалительная реакция на месте инокуляции вируса в кожу или роговицу, параличи, возникающие у животного в результате введения вируса в мозг, и т. д. Иногда размножение вируса можно выявить и в отсутствие видимой реакции со стороны организма-хозяина на пример, заражение куриных эмбрионов миксовирусами можно обнаружить по появлению гемагглютининов в аллантоисной жидкости.
Наилучшие результаты дают методы титрования, в основе которых лежит подсчет числа дискретных поражений на определенной площади слоя клеток, зараженных известным количеством содержащего вирус материала. В случаях когда число чувствительных к вирусу и доступных для него клеток можно практически считать бесконечно большим, как, например, при заражении фагом однослойной культуры бактерий на питательном агаре или при заражении вирусом сплошной однослойной культуры животных клеток, поражения, вызываемые вирусом, или бляшки, образуемые фагом, в данном смысле подобны колониям бактерий на плотной питательной среде.
Как число этих колоний пропорционально числу бактериальных клеток, содержащихся в титруемом препарате, так и число бляшек прямо пропорционально количеству вируса, добавленному к однослойной культуре образование зараженными клетками вирусных частиц, которые могут быть идентифицирован, например, по природе нуклеиновых кислот и симметрии частиц. 2 Образование зараженными клетками нуклеиновых кислот, которые могут обладать характерной плотностью при центрифугировании в градиенте плотности или характерным размером при электрофорезе в агарозном геле или центрифугировании в градиенте концентрации сахарозы. 3 Образование зараженными клетками или трансформированными клетками характерных антигенов, которые могут быть визуализованы с помощью окрашивания флуоресцирующими специфическими антителами либо вызывать изменения в клеточной мембране, приводящие к адсорбции гема. В прямом методе антитела, полученные к вирусным антигенам, сочетаются с флуорохромом и используются для окраски зараженных клеток.
Положительная реакция желто-зеленый цвет в люминесцентном микроскопе указывает на присутствие в клетках вирусных антигенов. Этот метод, следовательно, может быть использован для выявления клеточной трансформации, когда антитела вырабатываются, например, против ранних антигенов вируса SV40, или для выявления образования зрелых вирусов, когда получаются антитела против капсидных белков.
В непрямом методе антитела не сочетаются с флуорохромом.
Вместо этого после взаимодействия антител с антигенами в фиксированных препаратах клеток к ним добавляются антигамма-глобулиновые антитела, конъюгированные с флуорохромом. Этот метод более чувствителен и позволяет избежать конъюгации каждого индивидуального антитела с флуоресцентным красителем. Так, одни и те же флуоресцентные антитела к антителам кролика полученные у овец против кроличьих гамма-глобулинов могут быть использованы для окраски любых антител, образующихся у кроликов и взаимодействующих с вирусными антигенами в продуктивно зараженных или трансформированных клетках. Еще более непрямой, но значительно более чувствительный метод, не требующий использования флуоресцентного микроскопа - пероксидазный - антипероксидазный метод.
Согласно этому методу, кроличьи антитела взаимодействуют с антигенами фиксированных клеток и затем покрываются антителами козы к иммуноглобулинам кролика, конъюгированными с комплексами пероксидазы хрена и кроличьей антипероксидазы.
После этого препараты обрабатывают диамино-бензидином и перекисью водорода коричневая окраска указывает на присутствие антигенов. 4 Наличие антигенов на вирусных частицах может приводить к реакциям гемагглютинации, позволяющим проводить количественную оценку. У многих вирусов имеются антигены, которые могут адсорбироваться на эритроцитах и вызывать их слипание.
При взаимодействии большого количества вирусных частиц и эритроцитов образуется сеть клеток, и суспензия агглютинирует, т.е. эритроциты выпадают в осадок. Существует некоторая специфичность, заключающаяся в том, что определенные вирусы вызывают агглютинацию эритроцитов определенных животных, но если обнаружена активная комбинация, то гемагглютинация становится быстрым тестом, позволяющим определить титр вируса. Кровь отбирают в гепаринизированный шприц и эритроциты промывают трехразовым переосаждением в 0,85-ном NaCl при 200 g в течение 10 мин. Окончательный осадок эритроцитов суспендируют в 200-кратном объеме 0,85-ного раствора NaCl. Удобнее всего проводить тест на гемагглютинацию в микротитровальных пластинках.
В серию лунок микротитровальной пластинки вносят по 25 мкл 0,85-ного NaCl или ФСБ в первую лунку вносят 25 мкл суспензии вируса, и смесь перемешивают разведение 12. 25 мкл переносят затем из первой лунки во вторую разведение 14 и так далее, до конечного разведения 12048. После этого в каждую лунку добавляют по 25 мкл суспензии эритроцитов, смесь перемешивают и оставляют при 4С, комнатной температуре или 37 С до наступления гемагглютинации 1-2 ч. В лунках, где произошла агглютинация, осадок эритроцитов имеет неправильную форму, а в лунках, где гемагглютинации не было, клеточный осадок образует компактную точку на дне лунки.
Разведение в последней лунке, в которой происходила гемагглютинация, рассматривается как титр, и этому разведению приписывается значение 1 гемагглютинирующей единицы ГАЕ. Предшествующее разведение содержит соответственно 2 ГАЕ и так далее. 5 Образование зараженными клетками характерных ферментов, или ферментов, легко отличаемых по свойствам от соответствующих ферментов клеток-хозяев. 4.3.