Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens

Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens. За последнее десятилетие в области генетической инженерии растений достигнуты значительные успехи. Были разработаны разнообразные методы генетической трансформации и, в настоящее время осуществлена экспрессия чужеродных генов в растениях многих видов. Наиболее важным для развития генетической инженерии растений было открытие молекулярных основ опухолевых образований с помощью Agrobacterium tumefaciens 7. Вирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens сем. Rirobiaceae характеризуются присутствием в клетках большой плазмиды, так называемой Ti-плазмиды, весом более 150 т.п.н. см. Приложение 9. Агробактерии вызывают опухолевый рост у многих двудольных и голосеменных, а так же у некоторых однодольных растений 2,3. Для инфицирования in vivo необходимо повреждение тканей растения 12. После прикрепления к клеточной стенке растительной клетки агробактерии переносят часть Ti-плазмиды так называемой тДНК в ядро, где происходит ее стабильная интеграция в хромосому растения.

Доказано, что функция распознавания клеток и прикрепления к ним, а так же вырезание, перенос и, возможно, интеграция тДНК в растительный геном кодируется двумя хромосомными генами Chva и Chvb 13 и рядом генов vir-области, находящихся на Ti-плазмиде 14. После переноса в ядро растительной клетки, тДНК может интегрировать в геном в виде одной или нескольких копий 15. Встроенная тДНК имеет свойства, характерные для ДНК эукариот, что показано в экспериментах по гиперчувствительности к ДНК-азе I Schafer, 1984. В зависимости от типа Ti-плазмиды, в тДНК находится от семи до тринадцати генов, ответственных за опухолевый фенотип.

Гены 1 и 2 кодируют ферменты, участвующие в синтезе ауксина, индолилуксусной кислоты, в то время, как ген 4 кодирует изопентенилтрансферазу, синтезирующую цитокинин изопентенила денозин 5-монофосфат 16. Одновременная транскрипция генов 1,2 и 4 приводит к повышению уровня фитогормонов внутри трансформированных клеток.

Результатом этого является повышение митотической активности и образование опухоли.

Другие гены тДНК кодируют синтез так называемых опинов, из которых наиболее изучены нопапин и октопин.

Опины представляет собой производное аминокислот и сахаров, которые служат источником питания для агробактерий 14. В целом, образование корончатого галла представляет собой хорошо охарактеризованный пример генетической инженерии растений в природе. Мутации в вирулентных генах агробактерий. Наличие Ti-плазмид в клетках агробактерий является абсолютно необходимым условием патогенности микроорганизма.

Излеченные от Ti-плазмид штаммы агробактерий авирулентны. На вирулентность Agrobacterium tumefaciens оказывают влияние различные мутации, картируемые как на опухолевых плазмидах, так и на хромосомах. Ранние этапы взаимодействия агробактерий с растениями, так же как хемотаксис, прикрепление к поверхности растительной клетки и специфическое связывание в центрах инфекции контролируются генами, имеющими хромосомную локализацию. В хромосоме расположены некоторые гены, регулирующие экспрессию vir-генов Ti-плазмид 19. Присоединение агробактерий к клеткам растения является одним из первых этапов, определяющих эффективное взаимодействие.

Этот этап у Agrobacterium tumefaciens контролируют два связанных между собой хромосомных локуса Chva и Chvb, размерами 1,5 kb и 5kb, соответственно Дуглас и др, 1985. Гены этих локусов экспрессируются конститутивно. В результате транспозонного мутагенеза этих областей получают авирулентные или дефекнтые по прикреплению агробактерии.

Мутации в этих локусах сильно понижают или ингибируют вирулентность бактерии, но не для всех хозяев. Локус Chvb определяет синтез нейтрального циклического -D-гликана, который трансформируется в периплазматическое пространство клетки с помощью продукта гена Chva. Роль нейтрального -D-гликана в инфекционном процессе еще точно не установлена. Помимо циклического -D-гликана в прикреплении патогенных агробактерий к растительным клеткам принимают участие и другие полисахариды, в частности внеклеточные экзополисахариды.

Организация vir-генов Ti-плазмид. Вирулентные гены агробактерий на Ti- и Ri-плазмидах кластеризованы в области vir разметом около 30-35 kb, проявляющей в этих плазмидах значительную гомологию ДНК. Выявлена также гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens с tra-генами конъюгитивных плазмид. В Ti-плазмидах в области vir локализовано шесть различных групп комплементации A, B, C, D, E и G, организованных в единый регулон Stachel Nester, 1986. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет дополнительный локус vir F, расположенный справа от локуса vir E Kooykaas et al 1984. Мутации в генах и vir A, vir G, vir B и vir D придают агробактериям авирулентный фенотип, в отличие от большинства хромосомных мутаций, имеющих круг трансформируемых растений-хозяев.

Продукты генов vir-области контролируют процессинг тДНК в бактериальной клетке, ее перенос в растительную клетку и интеграцию в ядерный геном растения, причем эти процессы гены vir могут определять не только в цис, но и в транс положении по отношению к тДНК то есть находясь в разных репликонах.

Исходя из этого свойства области vir, сконструированы и успешно используются в практике удобные бинарные векторы для генетической инженерии растений Дрейпер с соавт, 1991. Для процессов вырезания тДНК из плазмиды точнее, высвобождения в процессе репликативного синтеза и ее переноса в растение необходимо фланкирование этой области особыми границами несовершенными прямыми повторяющимися последовательностями ДНК размером 24 , проявляющими значительную гомологию у всех изученных Ti- и Ri-плазмид.

Границы тДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид. В этой области сайт-специфические эндонуклеазы производят одноцепочечный разрыв, служащий началом репликации по типу разматывающегося рулона, происходящей в процессе транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает сохранение плазмиды в материнской клетке и появление ее копии в дочерней. Для нормального процессинга тДНК и ее переноса в растительную клетку особенно важна ее правая граница, которая одна может определять полярность переноса тДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии полностью авирулентными.

Замена ее на искусственно синтезированную, так же как и на левую, восстанавливает вирулентность микроорганизма. На процессинг тДНК в клетках бактерий влияют мутации в генах vir D, vir C и vir E оперонов, на транспорт т-комплекса в растительную клетку мутации в генах vir B и vir D оперонов. 1.1.2. Создание векторов на основе Ti-плазмид В начале восьмидесятых годов были сделаны первые попытки перенести чужеродные последовательности ДНК в растительные клетки либо с помощью транспозонного мутагенеза Uernals-teens et al 1980, либо путем сайт-специфической миграции генов в тДНК и последующей двойной рекомбинацией с Ti-плазмидой дикого типа Matrke et al 1981 leemans et al 1981. Однако, эти ранние эксперименты, основанные на двойной рекомбинации, занимали много времени, были довольно сложны и трансформации проходили с очень низкой частотой.

Необходимо было разработать более эффективные векторы, чтобы облегчить генетические манипуляции с бактериями и позволить селекцию и регенерацию трансформатов.

Сейчас используют две принципиально разные системы для введения чужеродных генов в растения с помощью Ti-плазмид 1. векторы 2. бинарные векторы. В основе создания векторов лежит тот факт, что гены тДНК не для растительных клеток, и любая последовтельность ДНК, встроенная между границами тДНК, может интегрировать в хромосому растительной клетки и нормально там экспрессироваться Zambryski et al 1983. В векторых системах тДНК можно заменить, например, на последовательность pBR322, а чужеродную ДНК, которую предполагается перенести в растения, нужно проклонировать в этом же векторе.

Затем путем гомологичной рекомбинации эта чужеродная ДНК может быть перенесена на Ti-плазмиду реципиентного штамма агробактерии рис. 2. Одним из первых таких векторов на основании Ti-плазмид авляется pGV3850 Zambryski et al 1983. В нем все гены, ответственные за синтез фитогормонов, были заменены на последовательность pBR322. ДНК pBR322 обеспечивала гомологию для области тДНК pGV3850 с любыми производыми pBR, несущими клонированный ген. Гены, кодирующие различные маркерные белки для быстрого отбора трансгенных растений, были встроены в pGV3850 De Blocle, 1984. Была разработана система трехродительного скрещивания для переноса любых производных pBR322 из E. coli в A. tumefaciens pGV3850 Van Haute et al 1983. В настоящее время сконструированы и успешно используются и другие векторы на основе Ti-плазмид Royers et al 1988. Рис. 2. Схемы А и бинарной Б векторных систем. vir область вирулентности.

HOM области гомологии, в пределах которых может происходить рекомбинация, приводящая к образованию коинтегратов.

LB и RB левая и правая границы тДНК. MCS - сайт для клонирования. РТМ маркет трансформации для растений. RES маркер устойчивости к антибиотику для бактерий.

OriT начало переноса и bom-сайт для мобилизации векторов при конъюгации. Col E1 начало репликации из плазмиды Col E1. RK2 начало репликации из плазмиды широкого круга хозяев RK2. Система бинарных векторов основана на том, что область тДНК и гены vir могут распологаться на разных плазмидах Hockemu et al 1983. В таких системах обычно присутствуют два элемента 1 Ti-плазмида-помощник, в которой тДНК польностью делетирована. Эта плазмида несет в своем составе гены vir, действующие in trans. 2 Плазмида широкого круга хозяев, имеющая сайты для клонирования и маркерные гены для селекции растений, ограниченные правой и левой фланкирующими последовательностями тДНК An et al 1988 рис Обе описанные выше системы векторов предполагают этапах сборку нужных конструкций в промежуточных векторах, например в pAP2034 Veltena, Sehell 1987 или pRT103 Topter et al 1983 а затем перенос из в готовом виде в рецепиентные штаммы агробактерий. 1.1.3.