Разработка система трансформаций растений с помощью Agrobacterium tumefaciens

Разработка система трансформаций растений с помощью Agrobacterium tumefaciens. Большинство первоначальных экспериметнов по генетической трансформации растений было предпринято с помощью заражения пораненных растительных клеток с помощью агробактерий с немодифицированными Ti-плазмидами.

Для сохранения стерильности часто инфицировали эксплантаты in vitro вместо целых растений. Бактерии затем удаляли, добавляли в среду цефотоксин или карбенициллин. Трансформанты отбирали на безгормональной среде. В дальнейшем по мере создания обезоруженных векторов и новых селективных маркеров, был разработан более эффективный метод, дающий большое число трансформантов кокультивирование агробактерий с растительными протопластами либо с эксплантантами листьев.

Было показано, что кокультивирование протопластов с агробактериями, либо с бактериальными приводит к образованию опухоли Marton et al 1979, Wullems et al 1981. Затем подобный подход был успешно применен для трансформации растительных клеток агробактериями, несущими в составе тДНК химерные селективные маркеры Fraley et al 1983, Herrera-Estrella et al 1983. Этот метод был в дальнейшем улучшен использованием так называемых фидерных культур Fraley et al 1983. Однако, все перечисленные методы пригодны только для трансформации растений, которые можно легко регенерировать из протопластов например, табак и петуния.

Эту проблему мрожно легко преодолеть кокультивируя агробактерии с листовыми дисками вместо протопластов Horch et al 1985 Rogers et al 1986 Lloyd et al 1986. Стерильные листовые диски с агробактериями, несущими в составе обезоруженного вектора какой-либо селективный маркер устойчивости к антибиотику. Затем кусочки листьев культивируют два дня на фидерных чашках со средой для образования побегов.

После этого их переносят на среду с цефотоксином для уничтожения бактерий и с каким-либо антибиотиком например, с для отбора трансформантов. Регенерировавшие побеги дают корни, после чего растения переносят в почву для проведения дальнейших экспериментов. Поскольку метод трансформации листовых дисков представляет собой идеальное сочетание высокой частоты трансформации с легкой и быстрой и регенерацией трансформантов, этот подход стали использовать во многих лабораториях мира. Кроме того были предложены некоторые модификации метода.

Для повышения частоты трансформации листовых дисков Arabiodopsis было предложено обрабатывать агробактерии Sheikholeskam a. Week S, 1987, который является индуктором генов vir Stachel et al 1985. Однако метод трансформации листовых дисков применим для трансформации только тех видов растений, которые могут регенерировать побеги из недифференцированных клеток в месте поранения. Наряду с методом трансформации листовых дисков широко используются конъюгированные агробактерии со стеблевыми сегментами An et al 1986, клетками суспензированной культуры Scott a. Draper, 1987, микрокаллусами Pollock et al, 1985 и прорастающими семенами Feldmam a. Markis, 1987. Метод трансформации семян агробактериями был впервые применен для арабидопсиса и заслуживает особого внимания, так как не требует работы с культурой ткани. 1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов, перенесенных в растение Чужеродные ДНК, перенесенные в растительные клетки с помощью различных методов, обычно встраиваются в ядерный геном и наследуются в соответствии с законами Менделя De Block et al 1984 Horsch et al 1984. Области ингерации, по видимому, распределены случайным образом по геному.

Встраивание генов по определенным сайтам было ранее описано в системах животных клеток Smithies et al 1985 Maniatis, 1985 и недавно подобный подход был успешно применен для трансформации растений Paszkowski et al 1988. В большинстве случаев последовательности чужеродной ДНК встраиваются в один локус либо в одной копии, либо в виде кластера тандемных вставок, что было показано с помощью гибридизации in situ Mouras et al 1986. Однако, часто наблюдаются множественные вставки в два или более участков на разных хромосомах De Block et al 1984 Peerbolte et al 1986a, b Feldmann a. Marus, 1987. В связи с этим во многих случах была получена контрансформация физически несцепленных генов, сегрегация некоторых проходила в поколении F1 De Framond et al 1986 Simpson et al 1986. Чужеродыне гены обычно передаются потомству с высокой степенью стабильности при мейозе Muller et al 1987. Однако, иногда наблюдали случайную потерю трансформированного фенотипа после мейоза Potrykus et al 1989. Возмножно, это происходило из-за активации чужеродного гена например, при метилировании ДНК. Интеграция чужеродной ДНК во внеядерные геномы, например, в хлоропластную ДНК De Block et al 1980, так же происходит по неменделевскому типу наследования по материнской линии.

Используя метод гибридизации по Саузерну Southern, 1975 для анализа трансформантов и их потомства, многие исследователи показали, что часто наблюдается встраивание укороченных, тандемных или перестроенных копий чужеродных генов, особенно после прямого переноса ДНК в протопласты Krens et al 1985. Появление тандемов, часто от 5 до 20 копий, можно объяснить рядом рекомбинаций перед интеграцией в геном Szernilofsky et al 1986 Wirtz et al 1987. Образование инвертированных повторов является основным типом перестроек чужеродной ДНК при применении векторов, содержащих тДНК Ti-плазмиды Jorgensen et al 1987. Итак, при проведении опытов по трансформации растений, необходимо принимать во внимание тот факт, что чужеродная ДНК может подвергаться различным модификациям перед встраиванием в геном хозяина.

Однако, и после интеграции могут происходить различные ее перестройки, обычно во время мейоза Czernilofsky et al 1986. В таких случаях только перекрестное опыление тщательно отобранных трансформантов с наиболее желаемым генотипом и фенотипом дает потомство с предсказуемыми призанаками. 1.1.6.