Принципы конструирования рекомбинантных противовирусных вакцин. Важным условием получения эффективного вакцинного препарата является соблюдение основных принципов его производства.
Конструирование рекомбинантных противовирусных вакцин предполагает 1 получение соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты 2 выбор высокоактивной и хорошо изученной в иммунологическом отношении модели вектора-носителя и клонирование соответствующего гена или генов 3 выбор системы экспрессии клонированного гена, способной обеспечить максимальный выход и функциональную полноценность продукта 4 создание достаточно удобных и по возможности универсальных векторов для целевой доставки генов в клетки и ткани организма. 1. ПОЛУЧЕНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ФРАГМЕНТА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ Для конструирования рекомбинантных РНК или ДНК необходимо получить фрагмент нуклеиновой кислоты, который в дальнейшем и будет встраиваться в векторную молекулу.
Фрагменты ДНК для встраивания в вектор можно получить непосредственно из хромосомной ДНК, расщепив ее рестриктазами или разрушив случайным образом например, с помощью ультразвука на сегменты с примерно одинаковой длиной.
Выделение генов с помощью вырезания из генома, как правило, состоит из четырех этапов 1 получение клонотеки фрагментов генома 2 выявление фрагментов генома, содержащих необходимый ген, и точная локализация гена в данном фрагменте 3 вырезание гена из фрагмента ов с помощью рестриктаз и сшивка участков гена с помощью ДНК-лигазы фага Т4, если эти участки получены из различных фрагментов 4 амплификация гена в составе векторной молекулы.
Указанный способ получения генов является наиболее приемлимым применительно к протозойным возбудителям, бактериям и для некоторых сложно устроенных ДНК-содержащих вирусов. Такие операции проводятся, в частности, при создании так называемых библиотек генов, то есть набора одинаковых векторных систем, в совокупности несущих в себе весь геном данного организма.
Однако этот подход имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, очень сложна задача подбора рестриктаз, позволяющих вырезать из геномной ДНК или клонированного фрагмента генома цельный ген. Как правило, вместе с геном остаются фланкирующие его лишние нуклеотидные последовательности, что мешает дальнейшему использованию этого гена, или же рестриктазы отрезают часть гена, делая его функционально неполноценным. Во-вторых, создание клонотеки генома возбудителя представляет специальную задачу и требует больших затрат времени.
Наконец, для ряда ДНК-содержащих вирусов паповавирусы доказан сплайсированный характер структуры генов. Вполне понятно, что выделенные гены этих вирусов вследствие наличия интронных областей не будут проявлять функциональной активности в бактериальных клетках и окажутся непригодными при решении задач по конструированию рекомбинантных противовирусных вакцин. В-третьих, если ген составляет незначительную долю от всей геномной ДНК, то возникают большие трудности с его изоляцией и идентификацией. Наиболее распространенным является путь получения генов через синтез ДНК-копий кДНК информационных или каких-либо других в оптимальном случае - индивидуальных РНК путем их обратной транскрипции.
Данный способ включает в себя три этапа 1 выделение высокоочищенных мРНК, кодирующих индивидуальные структурные белки, либо выделение геномных РНК вирусов 2 синтез двухцепочечной ДНК гена на матрицах РНК 3 амплификация гена с помощью методов молекулярного клонирования.
Как отмечалось, первым этапом в получении генов с помощью методов обратной транскрипции служит выделение и очистка геномных РНК и мРНК. Геномные РНК выделяют главным образом из очищенных вирионов, а мРНК - из инфицированных клеток. Для выделения мРНК из инфицированных клеток используют различные способы. В одном из вариантов выделение мРНК из инфицированных клеток проводят непосредственно из лизированных клеток лизис осуществляют в денатурирующих средах в целях предотвращения разрушающего действия нуклеаз на мРНК с последующей экстракцией фенолом и хлороформом или центрифигурированием лизата через подушку 5,7M СsCl для освобождения от клеточных ДНК и заключительной аффинной хроматографией на олиго dТ -целлюлозе поли У -сефарозе. Выделение мРНК можно проводить и из очищенных полирибосом инфицированных клеток.
В случае необходимости получения специфических мРНК, кодирующих индивидуальные структурные белки возбудителя, используют следующий способ.
Инфицированные вирусом клетки разрушают механическим путем или химическими методами использование неионных детергентов. Клеточный лизат освобождают от ядер и митохондрий методом дифференциального центрифугирования и подвергают хроматографии на антительном сорбенте. При этой процедуре с антителами, специфичными к определенному структурному белку возбудителя, связываются полисомы, осуществляющие синтез этого белка. Также может быть использован метод непрямой иммунопреципитации полисом, при котором комплекс антитело - полисома преципитируется из раствора добавлением второго антитела, специфичного к первому.
В качестве второго антитела чаще всего берут фиксированные формалином клетки Staphilococcus aureus, на поверхности которых находится так называемый белок А, имеющий сродство к Fc-фрагментам Ig. Из полисом, полученных одним из описанных способов, далее уже выделяют мРНК. Другой путь выделения индивидуальных мРНК базируется на свойстве мРНК взаимодействовать с комплементарными ДНК, связанными с твердым носителем целлюлоза, сефароза, нитроцеллюлозные фильтры. Этот метод отбора и очистки специфических мРНК является самым эффективным.
Однако его применение возможно только при наличии соответствующих комплементарных ДНК. Получение препарата очищенной мРНК позволяет перейти к работам по синтезу гена с помощью обратной транскрипции, которую осуществляют с помощью ревертазы AMV в специально подобранных условиях. В процессе обратной транскрипции матрицей служит мРНК, а затравкой олиго dT12-18 для мРНК, имеющих поли А -тракт или химически синтезированный олигонуклеотид, комплементарный 3 -концу мРНК. После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и разрушения РНК чаще используется обработка щелочью осуществляют синтез второй цепи ДНК. В этой реакции матрицей служит первая цепь ДНК. Реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой.
После получения двухцепочечной кДНК следует стадия получения гена, заключающаяся в гидролизе одноцепочечного участка ДНК, соединяющего первую и вторую цепи, нуклеазой S1. Для получения необходимых участков РНК используют две группы способов 1 расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК в заданном месте 2 синтез РНК ферментативный на ДНК- или РНК-матрицах и химический. Расщепление полирибонуклеотидной цепи РНК может осуществляться в присутствии различных ферментов.
Для этой цели используют ферменты рибонуклеазу H, нуклеазы, ковалентно связанные с олигонуклеотидами например, стафилококковая нуклеаза, рибозимы например, рибозим L-19 . Исторически первым способом направленной ферментативной фрагментации РНК называемой также адресованной, сайт-направленной или сайт-специфической фрагментацией РНК является разработанный в Московском университете метод гидролиза РНК ферментом РНКазой H в присутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов.
Этот метод до сих пор остается наиболее универсальным способом направленной фрагментации РНК. Метод основан на свойстве РНКазы Н расщеплять полирибонуклеотидную цепь РНК в составе ДНК-РНК-гетеродуплекса.
К участку РНК, по которому планируется провести ее фрагментацию, синтезируется комплементарный олигодезоксирибонуклеотид длиной в 6-10 нуклеотидных остатков. Далее получают комплекс этого олигонуклеотида с РНК, который затем обрабатывают ферментом. В работе обычно используют РНКазу Н из Escherichia coli - вполне доступный фермент, который может быть довольно легко очищен от всех сопутствующих нуклеазных примесей. Этот метод нашел достаточно широкое применение для сайт-специфического расщепления вирусных и рибосомных РНК, а также для идентификации продуктов процессинга некоторых РНК. Важным достоинством рассматриваемого метода является и то, что в результате гидролиза РНК рибонуклеазой Н образуются фрагменты, у одного из которых на 5 -конце содержится фосфатная группа, а у другого 3 -конец свободен нефосфорилирован. Такие фрагменты можно прямо использовать в реакции ферментативного лигирования.
Серьезным ограничением этого метода является то, что участок РНК, с которым связывается комплементарный ему олигодезоксирибонуклеотид, должен иметь однотяжевую конформацию и находиться на поверхности макромолекулы РНК, представляющей собой в условиях расщепления компактную глобулу с развитой вторичной структурой.
В отдельных случаях это ограничение удается преодолеть, используя достаточно длинные олигодезоксирибонуклеотиды 15-20-членные, которые предварительно отжигают с частично или полностью денатурированной РНК. Другое ограничение метода фрагментации полирибонуклеотидов РНКазой Н в присутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов заключается в том, что в общем случае предсказать, какая из фосфодиэфирных связей в гетеродуплексе или в непосредственной близости от него подвергнется расщеплению, не удается.
Более того, фермент зачастую гидролизует не одну, а несколько соседних межнуклеотидных связей. Ясно, что для последующего конструирования рекомбинантных РНК такие фрагменты могут оказаться непригодными.
Расщепление РНК может проводиться и с участием нуклеаз, ковалентно связанных с олигонуклеотидами. Идея, лежащая в основе данного подхода к направленной фрагментации РНК, восходит к концу 60-х годов, когда Н. И. Гриневой и ее сотрудниками был предложен метод олигонуклеотид-направляемой модификации нуклеиновых кислот. Принцип этого метода заключается в том, что с 5 - или 3 -концевым остатком олигонуклеотида, комплементарного заданному району ДНК и РНК, связывают модифицирующий агент, который после образования дуплекса атакует одно из ближайших к нему оснований.
Реагентами этого типа удалось направленно фрагментировать фенилаланиновую тРНК из дрожжей, РНК-компонент M1 РНК РНКазы Р, а также 16S рибосомную РНК E.coli. Однако, как и в случае РНКазы Н, расщепление РНК олигонуклеотид-нуклеазой зачастую проходит по нескольким межнуклеотидным связям, что несколько ограничивает возможности применения этого метода для получения рекомбинантных РНК. Для расщепления РНК применяют также рибозимы природные РНК и синтетические полирибонуклеотиды, способные катализировать целый ряд превращений у других РНК . Первый рибозим, напоминающий по своим свойствам эндонуклеазы рестрикции, был получен Т. Чеком. В научной литературе его обозначают как рибозим L-19. Этот рибозим представляет собой РНК длиной в 395 нуклеотидных остатков, в 5 -концевой области которой имеется гексануклеотидная последовательность GGAGGG, ответственная за специфичность расщепления предшественника 26S РНК при самосплайсинге.
Эта последовательность комплементарна CUCUCU последовательности, расположенной на 3 -конце первого экзонного участка предшественника 26S РНК. Если эту РНК заменить другой, но обязательно содержащей доступную для комплементарного связывания CUCUCUA последовательность, то рибозим L-19 в присутствии гуанозина или гуаниловых нуклеотидов со свободной 3 -гидроксильной группой расщепит ее. Источником необходимых участков РНК может служить такой способ, как синтез фрагментов РНК. Ферментативный синтез сегментов РНК осуществляют с использованием разнообразных генно-инженерных конструкций.
Однако в настоящее время в подавляющем большинстве случаев для препаративного получения РНК используются РНК-полимеразы, закодированные в геномах ряда ДНК-содержащих бактериофагов Т3, Т7 и SP6 . Они характеризуются очень высокой активностью и, в отличие от клеточных РНК-полимераз, состоят из одной полипептидной цепи. Важно также то, что инициация и терминация синтеза РНК этими полимеразами происходит на одном определенном нуклеотидном остатке.
Полученные одним из способов фрагменты нуклеиновых кислот в дальнейшем встраивают в векторные молекулы.
Подводя итог изложенному, можно сделать вывод, что получение генов протективных белков возбудителей представляет собой достаточно сложную задачу. Однако ее решение необходимо для создания в конечном счете рекомбинантных противовирусных вакцинных препаратов. 1.2. ВЫБОР ВЫСОКОАКТИВНОЙ И ХОРОШО ИЗУЧЕННОЙ В ИММУНОЛОГИЧЕСКОМ ОТНОШЕНИИ МОДЕЛИ ВЕКТОРА-НОСИТЕЛЯ И КЛОНИРОВАНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ГЕНА 1.2.1.