Разнообразие векторных молекул

Разнообразие векторных молекул. Под понятием вектор понимается молекула нуклеиновой кислоты, способная после введения в клетку к автономному существованию за счет наличия в ней сигналов репликации и транскрипции.

Векторные молекулы должны обладать следующими свойствами 1 способностью автономно реплицироваться в клстке-реципиенте, то есть быть самостоятельным репликоном 2 содержать один или несколько маркерных генов, благодаря экспрессии которых у клетки-реципиента появляются новые признаки, позволяющие отличить трансформированные клетки от исходных 3 содержать по одному или, самое большее, по два участка сайта для различных рестриктаз в разных районах в том числе в составе маркерных генов, но не в области, ответственной за их репликацию.

В зависимости от целей эксперимента векторы можно условно разделить на две группы 1 используемые для клонирования и амплификации нужного гена 2 специализированные, применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов. Вторая группа векторов объединяет векторы, призванные обеспечить синтез белковых продуктов клонированных генов.

Векторы для экспрессии содержат последовательности ДНК, которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в штаммах клеток. В качестве прокариотических векторов используются плазмиды, бактериофаги в качестве эукариотических векторов применяют вирусы животных и растений, векторы на основе 2 мкм дрожжей и митохондрий и ряд искусственно сконструированных векторов, способных реплицироваться как в бактериальных, так и в эукариотических клетках челночные векторы. Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетках.

Большинство плазмидных векторов получено на основе природных плазмид ColE1, pMB1 и p15A. Бактериальные плазмиды делят на два класса. Одни плазмиды например, хорошо изученный фактор F, определяющий пол у E.coli сами способны переходить из клетки в клетку, другие такой способностью не обладают. По ряду причин, и прежде всего для предотвращения неконтролируемого распространения потенциально опасного генетического материала, подавляющее большинство бактериальных плазмидных векторов создано на базе плазмид второго класса.

Многие природные плазмиды уже содержат гены, определяющие устойчивость клеток к антибиотикам продукты этих генов - ферменты, модифицирующие или расщепляющие антибиотические вещества. Кроме того, в эти плазмиды при конструировании векторов вводятся дополнительные гены, определяющие устойчивость к другим антибиотикам.

На рис. 4 показан один из самых распространенных плазмидных векторов E.coli - pBR322. Он сконструирован на базе детально изученной плазмиды E.coli - колициногенного фактора ColE1 - и содержит ориджин репликации этой плазмиды. Особенность плазмиды ColE1 и pBR322 соответственно состоит в том, что в присутствии ингибитора синтеза белка антибиотика хлорамфеникола опосредованно ингибирующего репликацию хозяйской хромосомы ее число в E.coli возрастает от 20-50 до 1000 молекул на клетку, что позволяет получать большие количества клонируемого гена. При конструировании вектора pBR322 из исходных плазмид был делегирован целый ряд лишних сайтов для рестриктаз.

В настоящее время наряду с множеством удобных векторных систем для E.coli сконструированы плазмидные векторы для ряда других грамотрицательных бактерий в том числе таких промышленно важных, как Pseudomonas, Rhizobium и Azotobacter, грамположительных бактерий Bacillus, низших грибов дрожжи и растений.

Плазмидные векторы удобны для клонирования относительно небольших фрагментов до 10 тыс. пар оснований геномов небольших размеров. Если же требуется получить клонотеку или библиотеку генов высших растений и животных, общая длина генома которых достигает огромных размеров, то обычные плазмидные векторы для этих целей непригодны. Проблему создания библиотек генов для высших эукариот удалось решить с использованием в качестве клонирующих векторов производных бактериофага. Среди фаговых векторов наиболее удобные системы были созданы на базе геномов бактериофагов и М13 E.coli. ДНК этих фагов содержит протяженные области, которые можно делегировать или заменить на чужеродную ДНК, не затрагивая их способности реплицироваться в клетках E.coli. При конструировании семейства векторов на базе ДНК фага из нее сначала путем делений коротких участков ДНК были удалены многие сайты рестрикции из области, не существенной для репликации ДНК, и оставлены такие сайты в области, предназначенной для встраивания чужеродной ДНК. В эту же область часто встраивают маркерные гены, позволяющие отличить рекомбинантную ДНК от исходного вектора.

Такие векторы широко используются для получения библиотек генов. Размеры замещаемого фрагмента фаговой ДНК и соответственно встраиваемого участка чужеродной ДНК ограничены 15-17 тыс. нуклеотидных остатков, так как рекомбинантный фаго - Рисунок 4. Детальная рестрикционная карта плазмиды pBR322. вый геном, который на 10 больше или на 75 меньше генома дикого фага, уже не может быть упакован в фаговые частицы. Таких ограничений теоретически не существует для векторов, сконструированных на базе нитчатого бактериофага М13. Описаны случаи, когда в геном этого фага была встроена чужеродная ДНК длиной около 40 тыс. нуклеотидных остатков.

Известно, однако, что фаг М13 становится нестабильным, когда длина чужеродной ДНК превышает 5 тыс. нуклеотидных остатков.

Фактически же векторы, полученные из ДНК фага М13, используются главным образом для секвенирования и мутагенеза генов, и размеры встраиваемых в них фрагментов намного меньше.

Эти векторы конструируются из реплекативной двутяжевой формы ДНК фага М13, в которую встроены полилинкерные участки пример такой конструкции показан на рис. 5 . В фаговую частицу ДНК включается в виде однотяжевой молекулы. Таким образом, этот вектор позволяет получать клонированный ген или его фрагмент как в двутяжевой, так и в однотяжевой форме. Однотяжевые формы рекомбинантных ДНК широко используются в настоящее время при определении нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера и для олигодезоксинуклеотид-направленного мутагенеза генов.

Перенос чужеродных генов в клетки животных осуществляется с помощью векторов, полученных из ДНК ряда хорошо изученных вирусов животных - SV40, некоторых аденовирусов, вируса папиломы быка, вируса оспы и так далее. Конструирование этих векторов проводится по стандартной схеме удаление лишних сайтов для рестриктаз, введение маркерных генов в области ДНК, не существенные для ее репликации например, гена тимидин-киназы tk из HSV вируса герпеса, введение регуляторных районов, повышающих уровень экспрессии генов.

Удобными оказались так называемые челночные векторы, способные реплицироваться как в клетках животных, так и в клетках бактерий. Их получают, сшивая друг с другом большие сегменты векторов животных и бактерий например, SV40 и pBR322 так, чтобы районы, ответственные за репликацию ДНК, остались незатронутыми.

Это позволяет проводить основные операции по конструированию вектора в бактериальной клетке что технически намного проще, а затем полученную рекомбинантную ДНК использовать для клонирования генов в животной клетке. Рисунок 5. Рестрикционная карта вектора М13 mp8. 1.3. ВЫБОР СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ КЛОНИРОВАННОГО ГЕНА, СПОСОБНОЙ ОБЕСПЕЧИТЬ МАКСИМАЛЬНЫЙ ВЫХОД И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ ПОЛНОЦЕННОСТЬ ПРОДУКТА Полученные рекомбинантные молекулы переносятся в определенные группы клеток, которые должны обеспечить экспрессию этих генов, то есть синтез соответствующих белков в количествах, экономически рентабельных по сравнению с обычной технологией их производства.

Обычно для данной цели используют бактериальные или дрожжевые культуры клеток, а также системы экспрессии на основе эукариотических клеток. Из бактериальных клеток наиболее изученной в молекулярно-генетическом отношении является грамотрицательная бактерия Escherichia coli, поэтому для нее можно с наибольшей определенностью планировать генноинженерные конструкции.

Однако E. coli слабо освоена промышленностью. Кроме того, она относится к условно-патогенным для человека микроорганизмам, что может создать трудности при получении на ее основе фармацевтических препаратов. Отмеченные недостатки E. coli легко преодолеваются при конструировании методами генной инженерии штаммов-продуцентов на основе клеток Bacillus subtilis. Данная почвенная бактерия безопасна для человека и животных и прекрасно освоена микробиологической промышленностью. Бактерия B. subtilis по степени изученности следует за E. coli. Важное отличие ее от E. coli - способность эффективно секретировать во внешнюю среду целый ряд белков, поэтому особенно интересны работы по созданию штаммов-продуцентов B. subtilis, секретирующих чужеродные белки из клеток.

Однако данная бактерия имеет свои недостатки рекомбинантные плазмиды в B. subtilis характеризуются нестабильностью, выражающейся в перестройках и делециях ДНК бациллы секретируют в культуральную среду большое количество протеаз, что существенно усложняет вопрос максимализации генноинженерного получения целевого белка на основе бацилл-продуцентов.

Среди эукариотических микроорганизмов наиболее изученным является низший эукариот Saccharomyces cerevisiae. Одно из преимуществ S. cerevisiae как экспериментальной системы - простота и надежность ее генетического анализа. В клетках дрожжей имеется ферментативная система гликозилирования белков, которая обеспечивает возможность синтеза в них полноценных белков высших эукариот.

Аналогичных систем процессинга белков в бактериальных клетках нет. Многие штаммы дрожжей освоены микробиологической промышленностью. Доказана их безвредность для человека и животных. Именно на S. cerevisiae создан первый штамм-продуцент поверхностного антигена вируса гепатита Б, позволивший получить и испытать вакцину против данного вирусного заболевания человека. С появлением генной инженерии внимание многих исследователей привлекла система культивируемых клеток животных.

Особый интерес к культурам клеток животных стал проявляться после обнаружения того, что часть эукариотических генов раздроблена и лишь в системе клеток высших эукариот можно достичь правильной экспрессии таких генов. Кроме того, многие белки животных и их вирусов синтезируются первоначально в виде более высокомолекулярных предшественников, которые в результате специфического протеолитического процессинга переходят в так называемую зрелую форму.

Такой процессинг данных белков, по-видимому, можно ожидать лишь в системе клеток животных. Все это убедительно доказывает важность разработки экспрессирующей системы на основе клеток животных. Для обеспечения наиболее эффективной экспрессии клонированных генов в векторные молекулы встраивают определенные фрагменты ДНК, позволяющие увеличить выход чужеродного белка. Так, для достижения более высокого уровня экспрессии гена HBsAg в клетках E. coli были использованы различные по силе промоторы промоторы генов cat, kan, bla, trp и тандемно расположенных промоторов генов kan и trp. Уровни синтеза последовательностей HВsAg нативного и в составе химерных белков составляли в зависимости от используемых конструкций векторов от 100 до 10 молекул на клетку. 1.4. СОЗДАНИЕ ДОСТАТОЧНО УДОБНЫХ И ПО ВОЗМОЖНОСТИ УНИВЕРСАЛЬНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ЦЕЛЕВОЙ ДОСТАВКИ ГЕНОВ В КЛЕТКИ И ТКАНИ ОРГАНИЗМА Важным моментом при конструировании ДНК-вакцин является проблема целенаправленной доставки генов в необходимые клетки и защиты вводимых ДНК от действия нуклеаз крови.

В результате экспериментальной работы были созданы разнообразные конструкции, позволяющие доставлять целевые гены в клетки-мишени.

Одной из подобных конструкций является модель молекулярного вектора для доставки генов в такие клетки, как лимфоциты и кераноциты. В качестве модельного был использован ген, кодирующий гибридный белок фактор некроза опухолей-альфа - интерферон-гамма. В центре вектора находится интактная плазмидная ДНК, содержащая доставляемый ген, а на поверхности располагаются антитела к клеткам-мишеням.

Конъюгат полиглюкина со спермидином и антителами применяется для связи компонентов положительно заряженный спермидин обеспечивает связывание конъюгата с плазмидной ДНК . Описанный молекулярный вектор позволяет целенаправленно доставлять гены в клетки-мишени, сводя до минимума их попадание в другие виды клеток, защищать доставляемые гены от нуклеаз крови и использовать положительно заряженный комплекс спермидин-полиглюкин в качестве стимулятора проникновения ДНК в клетки.

В настоящее время также создана векторная модель для доставки в клетки костного мозга гена, кодирующего гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека чГ-КСФ . Данный белок относится к семейству гемопоэтических факторов роста и является одним из физиологических регуляторов, специфически и высокоэффективно стимулирующих пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических предшественников нейтрофилов. чГ-КСФ увеличивает продолжительность жизни клеток костного мозга, усиливает функциональную активность зрелых нейтрофилов.

Созданный вектор представляет собой многослойную конструкцию. Центральным ядром конструкции является плазмида pGGF8, содержащая ген чГ-КСФ. Ее окружает полисахаридная оболочка, которая состоит из полиглюкина и спермидина. Внешний белковый слой содержит смесь сывороточного альбумина и белка доставки - трансферина. Эффективность описанной векторной модели была доказана опытным путем.

Итак, при конструировании рекомбинантных противовирусных вакцин немаловажное значение имеет создание специального вектора-носителя, обеспечивающего адресную доставку генов и их защиту от действия нуклеаз крови. 2. ВАКЦИНА ПРОТИВ ЛЕЙКЕМИИ КОШЕК, ИЗГОТОВЛЕННАЯ С ПОМОЩЬЮ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ Возбудителем лейкемии кошек является ретровирус типа С. Вирус лейкемии кошек FeLV имеет в качестве генетического материала молекулу РНК. Заболеваемость и смертность среди домашних кошек в Швейцарии довольно высока.

Вакцина против FeLV, изготовленная традиционным путем, была разработана несколько лет тому назад и находится в продаже в Швейцарии. Высокая цена современных вакцин и отсутствие уверенности в отношении длительности эффекта и надежности вакцины вызвали необходимость создания вакцины с помощью генной инженерии. При конструировании рекомбинантной вакцины оболочечный протеин вируса env-ген клонировался в пивных дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Env-ген вначале лигировался с промотором дрожжей пируваткиназный промотор, а затем клонировался в так называемом Shuttle -векторе.

Вектор Shuttle челночный вектор может размножаться как в бактерии E. coli, так и в пивных дрожжах S. cerevisiae. Он содержит с одной стороны репликационные оригины как для дрожжей, так и для E. coli, а с другой стороны селекционный маркер для дрожжей leu2 ген и для E.coli резистентность к ампицилину. Из литра дрожжевой культуры выделяют множество миллиграмм env-протеина и затем тестируют в опыте по вакцинации.

Результат вселяет надежду 10 кошек были иммунизированы env-протеином, причем 4 дали ответ антителами. Через 2 недели провели заражение FeLV. Теперь все животные давали ответ антителами. Таким образом, полученная вакцина оказалась эффективным средством для борьбы с данным заболеванием.