Гомогенизация материала. Методы гомогенизации Разрушение клеток гомогенизатор Даунса 5-12 мл плотно прилегающий пестик.
Гипотонический шок гомогенизатор. Метод основанный на кавитации газов клеточная суспензия обогащенная газообразным азотом на 15-30 минут выдерживается при давлении до 65 атм при быстром понижении давления до атмосферного, вследствие выделения азота происходит разрушение клеток. Органеллы остаются интактными. Ультразвук. Состав среды в которой разрушают клетки определяется применяемым методом гомогенизации.
Для разрушения тканей используют изоосмотический раствор сахарозы из расчета 100 мл на 10 г сырого веса ткани, при этом нестрашно если раствора сахарозы будет немного больше, особенно при центрифугировании в роторе с большим объемом. Гипотоническая среда способствует разрушению клеток, но, если обработка длится слишком долго, при этом может происходить разрушение клеточных органелл. Остальные параметры среды трудно обобщить и каждый мембранный препарат требует индивидуального подхода.
Разделение субклеточных компонентов. Центрифугирование. Основан на различиях по скорости седиментации определяется весом, размером и формой частиц. Вещество, используемое для приготовления градиента должно быть легко растворимо в воде, физиологически безвредно и химически инертно его раствор должен быть невязким, прозрачным в видимой и УФ-областях спектра, должен создавать низкое осмотическое давление. Обычно разделение субклеточных компонентов проводят в градиенте плотности сахарозы.
Он удовлетворяет большинству указанных требований, но при высоких концентрациях он весьма вязок. Как правило разделение осуществляется за 3-4 часа или в течение ночи при 80.000 д или выше в роторе с подвесными стаканчиками. Обработка гомогената из печени крысы 10 мМ фосфатом калия увеличивает скорость седиментации митохондрий, не влияя на осаждение лизосом, что позволяет очищать последние в градиенте плотности перколла. Разделение в двухфазной системе, содержащей два полимера. Полезным и быстрым способом выделения мембран является разделение их в водной двухфазной системе декстран - полиэтиленгликоль ПЭГ, особенно если отсутствуют необходимые ультрацентрифуги и роторы.
Метод, продуктивность которого может быть легко повышена, основан на использовании целого ряда свойств мембран, включая электрический заряд, плотность, массу и гидрофобность. Различие в этих свойствах обуславливает разное распределение компонентов смеси между верхней и нижней фазами и поверхностью раздела.
По сродству к верхней фазе компоненты животной клетки располагаются в следующем порядке эндоплазматический ретикулум митохондрий лизосомы аппарат Гольджи плазматические мембраны Успех в применении фазовых систем зависит от адекватности выбора их состава. Качество разделения зависит не только от конкретного полимера пока число их ограничено - в основном используют декстран и ПЭГ, но и от других параметров молекулярной массы полимера, концентрации солей, рН, химической модификации полимера.
Электрофорез. С помощью высоковольтного электрофореза в свободном потоке можно получить препараты субклеточных мембран и органелл высокой степени чистоты. Подлежащую разделению смесь компонентов подают тонкой струйкой в разделяющий буфер, который движется в электрическом поле мембраны, несущие разный электрический заряд перемещаются в разделяющей ячейке со скоростью, определяемой их зарядом, при этом достигается 100 -ное разрешение. Это мягкий способ выделения мембран с высоким препаративным выходом.
Методику электрофореза в свободном потоке впервые применили для выделения лизосом и митохондрий из печени крысы. Таблица 1.