Ферменты - маркеры митохондрий. ФракцияМаркерный ферментМитохондрииВнутренняя мембранаСукцинатдегидрагеназа, Цитохромкидаза, Ротеном-нечувствительная NADH цитохром с редуктазаМитохондрииНаружная мембранаМоноаминооксидаза, Кинуренин-3-гидроксилаза В таблице 1 приведены ферментные маркеры, к которым относятся сравнительно стабильные ферменты, активность которых достаточно высока и ее удобно измерять.
Обычно эти измерения проводят как можно быстрее после выделения образец при этом хранят при 40С и не замораживают. Отмечено, что такой фермент, как цитохром с - редуктаза может оказаться лабильным и терять активность в замороженных препаратах мембран из печени. Для правильной оценки распределения фермента-маркера весьма существенным является пространственное расположение субстрат-связывающего сайта. Методики Субфракционирование мембран и компонентов матрикса митохондрий. Митохондрии выделяют из многочисленных источников стандартными методами.
Субфракционирование их для получения внутренних и наружных мембран и компонентов матрикса проводят после замораживания - оттаивания препарата и или обработки ультразвуком стандартного осадка митохондрий, суспендированных в среде, содержащей 1.2 М сахарозы и 2 мМ АТР 10 мг мембранного белка на 1 мл. При этом происходит разрушение митохондрий, а после центрифугирования в ступенчатом градиенте плотность сахарозы наружные мембраны концентрируются в полосе 0,45-1,12 М сахарозы, внутренние мембраны и компоненты матрикса собираются в осадке, под нижним слоем с концентрацией сахарозы 1,2 М, а промежуточная везикулярная фракция - между двумя предыдущими, в полосе 1,12-1,20М. Маркерами внутренних митохондриальных мембран служат ферменты - переносчики электронов.
Наружная митохондриальная мембрана, которая при фрагментации образует везикулы, сходные по плотности и морфологии с везикулами из плазматической мембраны содержит моноаминооксидазу.
Описан также метод выделения наружных митохондриальных мембран из печени крыс. Метод противоточного распределения митохондрий. Препараты митохондрий, выделенные из печени крысы, были исследованы Эрикссоном с помощью метода противоточного распределения. Митохондрий, входящие в состав каждого из этих препаратов, можно разделить на две основные популяции. Однако элетронно-микроскопическое исследование не позволило обнаружить никаких различий в структуре этих частиц.
Рабочая методика выделения митохондрий из печени крыс. Среда выделения 0,25 М раствор сахарозы, содержащий 0,001 М ЭДТА, рН 7,4 Сахароза - 0,25 М раствор НС1 - 1 н и 0,1 н растворы КОН - 1 н и 0,1 н растворы Все реактивы готовятся на бидистиллированной воде. Изолированную печень крысы погружают в 30 мл ледяной среды выделения. После 2х - Зх кратного промывания ткань измельчают ножницами на чашке Петри, стоящей на льду. Кашицу вновь помещают в стаканчик со свежей средой выделения и тщательно промывают.
После оседания кусочков ткани на дно, жидкость осторожно сливают и промывание повторяют еще дважды. Ткань переносят в гомогенизатор, добавляют 40 мл среды выделения и измельчают в течение 30 - 40 секунд. К гомогенату добавляют 40 мл среды выделения, перемешивают медленно вращающимся пестиком и разливают его в 2 центрифужных стакана. Центрифугируют в течение 10 минут при 0-2 ОС, при 600 д для удаления обломков клеток и ядерной фракции.
Супернатант осторожно сливают и хранят на льду, остатки объединяют и вновь гомогенизируют 20 секунд в 20 мл среды выделения. Гомогенат центрифугируют при 600 д 10 минут, супернатант объединяют с полученным ранее. Для осаждения митохондрии, объединенный супернатант центрифугируют в двух стаканах при 14000 g в течение 10 минут. Остатки объединяют в одном стакане и тщательно суспендируют с помощью пипетки на 1 мл в небольшом объеме среды выделения около 0,5 мл. .Маленькими порциями, при осторожном встряхивании добавляют 10 мл среды выделения и осаждают митохондрии 14000 g, 10 минут.
Осадок суспендируют в 0,25 М сахарозе, не содержащей ЭДТА, и вновь центрифугируют 14000 g, 10 минут. Супернатант сливают, на полученный осадок митохондрии осторожно наслаивают 0,2 - 0,3 мл 0,25 М сахарозы. Легким встряхиванием смывают верхний рыхлый слой осадка. Процедуру повторяют еще дважды и полученный плотный осадок митохондрии тщательно суспендируют с помощью пипетки в 0,4 - 0,5 мл 0,25 М сахарозы.
Густую суспензию митохондрии переносят в пробирку и хранят на льду.