рефераты конспекты курсовые дипломные лекции шпоры

Реферат Курсовая Конспект

Методика визначення субпопуляцiй Т-лiмфоцитiв

Работа сделанна в 1996 году

Методика визначення субпопуляцiй Т-лiмфоцитiв - раздел Биология, - 1996 год - Влияние малых доз радиации на клеточный иммунитет Методика Визначення Субпопуляцiй Т-Лiмфоцитiв. У Венознiй Кровi З Використанн...

Методика визначення субпопуляцiй Т-лiмфоцитiв. У ВЕНОЗНIЙ КРОВI З ВИКОРИСТАННЯМ МОНОКЛОНАЛЬНИХ СИВОРОТОК Специфiчнi антитiла зв язуються з мембранними антигена- ми живих клiтин, що знаходяться у суспензii.

Щоб запобiгти келiнгу i iндингу злущуванню антигенiв пiсля взасмодii з антитiлами, до суспензii клiтин добавляють 0.2 -й азид нат- рiю. У прямих методах IФА використовують специфiчнi до клiтинних антигенiв антитiла, коньюгуючi з флуорисцентною мiткою.

А маркування клiтин проводять як одноетапну реакцiю. У непрямих методах IФА в якостi антитiл використовують не мiченi антитiла до клiтинних антигенiв, а в якостi дру- гих - мiченi флуорохромом антитiла до iмуноглобулiнiв. Мар- кування клiтин проводять у два етапи.

Другi антитiла служать для виявлення зв язаних з клiти- ною перших антитiл. Непрямi методи, як правило, чутливiшi прямих. 1. Венозну кров 7 мл з антикоагулянтом 9.8 цитрат нат- рiю 0.5 мл, або 25 од мл гепарина розбавлясмо фосфатним буфером у спiввiдношеннi 1 1. Склад фосфатного буферу КН РО 1,15 г. Na HPO 0,2 г. КСl 0,2 г. NaCl 8 г. на 1мл. дистильованоi води До фосфатного буферу додасмо 2 г. сироватки альбумiнiв кролика. 2. На свiжоприготовлений одноступеневий фiкол-верографiно- вий градiснт 2 мл. нашаровусмо за допомогою пiпетки з грушею розбавлену ФБ фосфатним буфером кров у центри- фужнiй пробiрцi.

Методика виготовлення фiкол-верографiна. 24,4 г. фiколу-400 розчиняють у теплiй дистильованiй водi. Змiшують з 49,9 мл. 70 розчину верографiну. До- водять об см до 340 мл. Температура зберiгання розчину 8 С. 3. Пробiрки з градiснтом кровi центрифугусмо протягом 20-25 хв. 4. Вiдбирасмо пiпеткою з грушею середнiй опалесцуючий шар, що мiстить лiмфоцити у окремi пробiрки. 5. Вiдмивасмо популяцiю лiмфоциту вiд залишкiв градiснта фосфатним буфером двiчi, за допомогою центрифугування протягом 10 хв. Декантусмо.

Вiдмивку повторюсмо 2 рази. 6. Доводимо концентрацiю мононуклеарних клiтин за допомо- гою розведення ФБ до рiвня 1-5 х 10 кл. мл. Контроль концентраццii проводимо вкамерi Горясва в од- ному великому квадратi повинно мiститись 20 лiмфатич- них клiтин . 7. До 50 мкл одержаних клiтин добавлясмо мiкропiпеткою по 5 мкл. антисироватки LT3 - для визначення кiлькостi зрiлих Т-клiтин у венознiй кровi CD3 , LT1 - для зрiлих i майже зрiлих Т-лiмфоцитiв CD5 , LT4 - для визначення Т-хелперiв CD4 , LT8 - для визначення Т-супресорiв CD8 . 8. Iнкубусмо сумiш лiмфоцитiв з антисиворотками протягом 20-25 хв при кiмнатнiй температурi. 9. Вiдмивасмо мононуклеари вiд залишкiв не зв язаноi АС. Для цього у кожну пробiрку доливасмо по 2 мл ФБ з кро- лячим альбумiном 2.5 i центрифугусмо протягом 10 хв. Вiдмивку повторюсмо двiчi. 10. До 50 мкл отриманоi сумiшi добавляемо по 5 мкл ФIТЦ. Iнкубусмо 20-25 хв. 11. Проводимо вiдмивку вiд флуоресцуючих антитiл мононук- леари. Вiдмивку проводимо аналогiчно вiдмивцi вiд анти- сивороток тричi. 12. Мононуклеари за допомогою пiпетки наносимо на предметне скельце. 13. Скельця помiщасмо на пiдставки у чашки Петрi з розчином формалiну i фiксус- мо препарат у його парах на протязi 10 хв. 14. Зафiксо- ваний препарат пiдсушують при кiмнатнiй темпера - турi. Готовi препарати зберiгаються у холодильнiй камерi протягом 3-х дiб. 15. Аналiз препаратiв.

Пiдрахунок проводиться шляхом перерахунку флуоресцуючих клiтин на 100 клiтин проглянутих у препаратi.

Мiкроскопують за допомогою мiкроскопу з люмiнiсцентною насадкою, окуляр-7, об сктив-90. У якостi iмерсii використовус- ться водний розчин глiцерину. 2.3. МЕТОДИКА ПIДРАХУНКУ ЧИСЛА ЛЕЙКОЦИТIВ В КРОВI 1. Палець протерти ватою змоченою 70 розчином спитту. 2. Одноразовим стерильним скарифiкатором проколоти палець. 3. Першу краплю кровi зтерти ватою змоченою спиртом. 4. Декiлька крапель кровi з пальця витиснути на пред- метне скло. 5. Капiляром Салi 0,02 мл. кровi перенести в центри- фужну пробiрку з 0,4мл. 3 розчину оцтовоi кислоти. 6. Легким посту куванням по пробiрцi перемiшати вмiст i залишити пробiрку для руйнування еритроцитiв. 7. Притерти покривне скло до камери Горясва таким чи- ном, щоб з явилися Ньютоновi кiльця. 8. Пiдрахувати кiлькiсть клiтин в 25 великих квадра- тах камери Горясва. 9. Одержаний результат перерахувати за формулою Х 10 20, де Х - кiлькiсть клiтин в 25 великих квадратах. Нормальна кiлькiсть лейкоцитiв у дорослоi людини коливас- ться в межах 4500-10000 в 1 куб.мм. 2.4 МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ ДИФЕНРЕНЦIЙОВАНОI ФОРМУЛИ ЛЕЙКОЦИТIВ. Визначення загальноi кiлькостi бiлих кров яних тiлець, дас уяву проiх абсолютну кiлькiсть.

Але не дас вiдомостей про процентне спiввiдношення диференцiйовану формулу мiж рiзними видами лейкоцитiв i про якiснi змiни в iх морфологii при хворобливих станах. Визначення диференцiйованоi формули проводиться на фар- бованому мазку кровi.

Диференцiйована формула характерно змiнгюсться при рядi хворобливих станiв i мас надзвичайно важливе дiагностичне i прогностичне значення.

Нормальна диференцiйована формула дорослоi людини нас- тупна молодi нейтрофiльнi клiжтини - 0 паличкоядернi нейтрофiльнi клiтини - 0-4 сегментоядернi нейтрофiльнi клiтини - 55-70 лiмфоцити - 20-40 моноцити - 2-6 еозинофiльнi клiтини - 1-4 базофiльнi клiтини - 0-1 плазматичнi клiтини - 0-5 ВИГОТОВЛЕННЯ МАЗКА КРОВI. 1.Необхiдною умовою для правильного пiдрахунку морфо- логiчних особивостей кров яних клiтин являсться вда- лозроблений i добре забарвлений кров яний мазок.

Добре зроблений мазок кровi повинен вiдповiдати наступ- ним умовам а починасться на 1 см. вiд вузького краю предметного скла i закiнчусться на 2-3 см. вiд його другого краю. Загальна довжина мазка повинна охоплювати 1 2 - 3 4 скла. б мазок повине бути рiвномiрноi товщини, а не хвили- подiбний.

Правельний мазок кровi товщий на початку, поступо- во тоншас i закiнчусться у виглядi слiду, мов би залишеного тонкою щiточкою. в мазок повинен бути вiдокремленим вiд краю. Шар кровi не повинен доходити до другогоь краю скла. Приготування мазкiв проводиться слiдуючим чином пред- метне скло, на якому буде зроблено мазок, беруть за один кiнець великим i вказiвним пальцями правоi руки. Другий кiнець, вiдступаючи на 1 см. вiд краю, обережно дотикасться до свiжоiкраплi капiлярноi кровiiз пальця, нi в якому разi не торкаючись шкiри в мiсцi проколу.

Крапля кровi перехо- дить на скло, вона повинна мати дiаметр 2-3 мм. Предметне скло перекладають у лiву руку взявши його ве- ликим вказiвним i середнiм пальцямитак, щоб крапля знаходил ась зверху на предметному склi, з боку вказiвного i серед- нього пальцiв.

Шлiфоване скло, яким буде зроблено мазок вставлясться пiд кутом 40-45 на 1-2 мм перд краплею, придержуючи великим i вказiвним пальцями правоi руки край шлiфованого скла i обидва краi предметного скла. Шлiфоване скло рухають назад так, щоб воно торкалося кровi i крапля поширювалася в кутi мiж шлiфованим i предметним склом. потiм швидким рухом ру- хаючи скло в зв оротньому напрямку роблять мазок.

Протягом того часу коли робиться мазок, великий iвказiвний пальцi правоi руки ковзають по краях предметного скла i тим створюють необхiдну опору для накладання шару кровi. ФАРБУВАННЯ КРОВ ЯНОГО МАЗКА. Для якiсного дослiдження морфологii кров яних клiтин- фарбування кров яного мазка мас важливе значення.

Основу су- часного фарбування кров яних клiтин поклав петербуржський лiкар Д.Л.Романовсьий. В 1891 роцi вiн запропонував свiй барвник. В 1902 роцi Гiмза вдосконалив барвник Романовського. Барвник Романовського-Гiмза складасться з лужноi i кис- лоi частини. Лужна частина - азур 2, А кисла частина - еозин. Азур 2 забарвлений в яскраво-синiй колiр, а еозин в роже- во-червоний. Щоб приготувати основний розчин барвника розчиняють 30 г. азуру 2-еозину i 0,8г. азуру 2 в 250 мл. глiцерину, наг- рiваючи прицьому 90-120 хв. при 50 С, а потiм додають 250мл. чистого метилового спирту.

Пiсля вiдстоювання протягом 1-7 днiв при кiмнатнiй температурi фiльтрують. ФIКСАЦIЯ КРОВ ЯНОГО МАЗКА. Перед фарбуванням мазок кровi фiльтрують. Це робиться для денатурацii бiлкiв у клiтинах, при збереженнi iхжиттсвоi структури iж для закрiплення клiтин на предметному склi. Для фiксацii використовусться абсолютний метиловий алкоголь. Час фiксацii - 3-5 хв. Перед роботою, пiсля фiксацii, препарат заливають робо- чим розчином розведеним барвника Романовського-Гiмза. I залишають на 20-40 хв. Потiм його промивають, сушать, див- ляться пiд мiкроскопом.

ПIДРАХУНОК ДИФЕРЕНЦIЙОВАНОI ФОРМУЛИ. Кров янi клiтини не розподiляються рiвномiрно повсьому препратi. На початку i в кiнцi мазка вiдкладасться бiльшiсть великих клiтин з малою питомою вагою моноцити, гранулоцити, а в серединi - бiльшiсть малих клiтин, з вели- кою питомою вагою лiмфоцити. Порiвняно найбiльш правильне спiввiдношення складасться на дiлянках показаних на малюнку Тому саме на них проводиться диференцiйований пiдрахунок кров яних тiлець.

Пiдрахунок робиться у виглядi меандрiв, щоб уникнути повторення одних i тих же клiтин. Пiдраховують не менше 25 клiтин краще по 100 в 4-х дiлянках вказаних на малюнку. РЕзультат виражають в. Замiсть 4-х малих меандрiв, можна без грубоi помилки, описати 2 великих меандри, тобто злити 2 малих поля вiдцен- тру з обох сторiн в одне велике, не роблячи розриву в сере- динi. В такому разi в кожному з обох великих полiв пiдрахо- вують мiнiмально по 50 клiтин краще по 100 i результат ви- ражають в. Для полегшення розрахункiв використовують еле- ментарнi механiчнi лiчильнi машини. 2.5

– Конец работы –

Эта тема принадлежит разделу:

Влияние малых доз радиации на клеточный иммунитет

Встановлено, що гостра дiя радiацii призводить до порушень в кiстковому мозку та тимусi. Наслiдком цих змiн с зниження iмунноi вiдповiдi органiзму… Iонiзуюче випромiнювання може викликати безлiч морфо- логiчних i… Порушення функцiй iмунноi системи можуть бути причиною ви- никнення ряду захворювань аутоiмунний тиреозит,…

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Методика визначення субпопуляцiй Т-лiмфоцитiв

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Все темы данного раздела:

Iсторiя дослiджень
Iсторiя дослiджень. Проблема впливу iонiзуючого випромiнення на органiзм людини i тварин с однiю з найважливiших в екологiчнiй медицинi, почина- ючи з 40-х рокiв нашого сторiччя. В березнi 1

Загальна характеристика лейкоцитiв
Загальна характеристика лейкоцитiв. Лiмфоiднi клiтини, з якими зв язанi всi iмуннi механiзми, з являються, дозрiвають та функцiонують в рiзних органах. В них знаходяться клiтини з обмеженим

Характеристика Т- i В-лiмфоцитiв
Характеристика Т- i В-лiмфоцитiв. В залежностi вiд функцiональних властивостей розрiзняють 2 основнi класи лiмфоцитiв Т- та В-клiтини. Тимусозалежнi лiмфоцити Т-лiмфоцити, в свою чергу, утво- рюють

Дiя iонiзуючого випромiнювання на органiзм людини
Дiя iонiзуючого випромiнювання на органiзм людини. Р.В.Петров зi спiвавт. 1994 вiдмiчають, що для iмунноi сис- теми характерна висока мобiльнiсть, пов язана з тим, що всi ii го- ловнi компоненти пр

Характеристика обстежених груп
Характеристика обстежених груп. Обстеження проводилися на практично здорових волонтерах, що навчаються в Черкаському державному унiверситетi на фа- культетах фiзвиховання та природничому факультетi

Визначення рiвня CD
Визначення рiвня CD. CD4 ,CD5 ,CD8 ЛIМФОЦИТIВ У ПЕРИФЕРИЧНIЙ КРОВI. 1.Кров брали стерильно з лiктьовоi вени вранцi, до вжи- вання iжi. Лiмфоцити видiляли з гепаринiзованоi кровi цен- трифугуванням

Статистична обробка даних
Статистична обробка даних. Одержанi цифровi результати були обробленi методом варiацiйноi статистики по Стьюденту за допомогою програми складеноi аспiрантом кафедри алгебри Андрущенко. Оскiл

Висновки
Висновки. РiвеньCD3 ,CD4 ,CD5 ,CD8 -лiмфоцитiв у практично здорових осiб, що мешкають на черкащинi знахо- диться на рiвнi показникiв жителiв iнших районiв Украiни. 2. У студентiв, що зазнали впливу

Лiтература
Лiтература. Анохин Ю.Н Норец Т.А Белоусова А.В. Стимуляция вос- становления иммунологической реактивности у мышей пос- ле облучения Иммунол 1989 N 1 c.44-46. 2. Баева Е.В. Влияние трийодтиронина на

Хотите получать на электронную почту самые свежие новости?
Education Insider Sample
Подпишитесь на Нашу рассылку
Наша политика приватности обеспечивает 100% безопасность и анонимность Ваших E-Mail
Реклама
Соответствующий теме материал
  • Похожее
  • Популярное
  • Облако тегов
  • Здесь
  • Временно
  • Пусто
Теги