Методика визначення субпопуляцiй Т-лiмфоцитiв. У ВЕНОЗНIЙ КРОВI З ВИКОРИСТАННЯМ МОНОКЛОНАЛЬНИХ СИВОРОТОК Специфiчнi антитiла зв язуються з мембранними антигена- ми живих клiтин, що знаходяться у суспензii.
Щоб запобiгти келiнгу i iндингу злущуванню антигенiв пiсля взасмодii з антитiлами, до суспензii клiтин добавляють 0.2 -й азид нат- рiю. У прямих методах IФА використовують специфiчнi до клiтинних антигенiв антитiла, коньюгуючi з флуорисцентною мiткою.
А маркування клiтин проводять як одноетапну реакцiю. У непрямих методах IФА в якостi антитiл використовують не мiченi антитiла до клiтинних антигенiв, а в якостi дру- гих - мiченi флуорохромом антитiла до iмуноглобулiнiв. Мар- кування клiтин проводять у два етапи.
Другi антитiла служать для виявлення зв язаних з клiти- ною перших антитiл. Непрямi методи, як правило, чутливiшi прямих. 1. Венозну кров 7 мл з антикоагулянтом 9.8 цитрат нат- рiю 0.5 мл, або 25 од мл гепарина розбавлясмо фосфатним буфером у спiввiдношеннi 1 1. Склад фосфатного буферу КН РО 1,15 г. Na HPO 0,2 г. КСl 0,2 г. NaCl 8 г. на 1мл. дистильованоi води До фосфатного буферу додасмо 2 г. сироватки альбумiнiв кролика. 2. На свiжоприготовлений одноступеневий фiкол-верографiно- вий градiснт 2 мл. нашаровусмо за допомогою пiпетки з грушею розбавлену ФБ фосфатним буфером кров у центри- фужнiй пробiрцi.
Методика виготовлення фiкол-верографiна. 24,4 г. фiколу-400 розчиняють у теплiй дистильованiй водi. Змiшують з 49,9 мл. 70 розчину верографiну. До- водять об см до 340 мл. Температура зберiгання розчину 8 С. 3. Пробiрки з градiснтом кровi центрифугусмо протягом 20-25 хв. 4. Вiдбирасмо пiпеткою з грушею середнiй опалесцуючий шар, що мiстить лiмфоцити у окремi пробiрки. 5. Вiдмивасмо популяцiю лiмфоциту вiд залишкiв градiснта фосфатним буфером двiчi, за допомогою центрифугування протягом 10 хв. Декантусмо.
Вiдмивку повторюсмо 2 рази. 6. Доводимо концентрацiю мононуклеарних клiтин за допомо- гою розведення ФБ до рiвня 1-5 х 10 кл. мл. Контроль концентраццii проводимо вкамерi Горясва в од- ному великому квадратi повинно мiститись 20 лiмфатич- них клiтин . 7. До 50 мкл одержаних клiтин добавлясмо мiкропiпеткою по 5 мкл. антисироватки LT3 - для визначення кiлькостi зрiлих Т-клiтин у венознiй кровi CD3 , LT1 - для зрiлих i майже зрiлих Т-лiмфоцитiв CD5 , LT4 - для визначення Т-хелперiв CD4 , LT8 - для визначення Т-супресорiв CD8 . 8. Iнкубусмо сумiш лiмфоцитiв з антисиворотками протягом 20-25 хв при кiмнатнiй температурi. 9. Вiдмивасмо мононуклеари вiд залишкiв не зв язаноi АС. Для цього у кожну пробiрку доливасмо по 2 мл ФБ з кро- лячим альбумiном 2.5 i центрифугусмо протягом 10 хв. Вiдмивку повторюсмо двiчi. 10. До 50 мкл отриманоi сумiшi добавляемо по 5 мкл ФIТЦ. Iнкубусмо 20-25 хв. 11. Проводимо вiдмивку вiд флуоресцуючих антитiл мононук- леари. Вiдмивку проводимо аналогiчно вiдмивцi вiд анти- сивороток тричi. 12. Мононуклеари за допомогою пiпетки наносимо на предметне скельце. 13. Скельця помiщасмо на пiдставки у чашки Петрi з розчином формалiну i фiксус- мо препарат у його парах на протязi 10 хв. 14. Зафiксо- ваний препарат пiдсушують при кiмнатнiй темпера - турi. Готовi препарати зберiгаються у холодильнiй камерi протягом 3-х дiб. 15. Аналiз препаратiв.
Пiдрахунок проводиться шляхом перерахунку флуоресцуючих клiтин на 100 клiтин проглянутих у препаратi.
Мiкроскопують за допомогою мiкроскопу з люмiнiсцентною насадкою, окуляр-7, об сктив-90. У якостi iмерсii використовус- ться водний розчин глiцерину. 2.3. МЕТОДИКА ПIДРАХУНКУ ЧИСЛА ЛЕЙКОЦИТIВ В КРОВI 1. Палець протерти ватою змоченою 70 розчином спитту. 2. Одноразовим стерильним скарифiкатором проколоти палець. 3. Першу краплю кровi зтерти ватою змоченою спиртом. 4. Декiлька крапель кровi з пальця витиснути на пред- метне скло. 5. Капiляром Салi 0,02 мл. кровi перенести в центри- фужну пробiрку з 0,4мл. 3 розчину оцтовоi кислоти. 6. Легким посту куванням по пробiрцi перемiшати вмiст i залишити пробiрку для руйнування еритроцитiв. 7. Притерти покривне скло до камери Горясва таким чи- ном, щоб з явилися Ньютоновi кiльця. 8. Пiдрахувати кiлькiсть клiтин в 25 великих квадра- тах камери Горясва. 9. Одержаний результат перерахувати за формулою Х 10 20, де Х - кiлькiсть клiтин в 25 великих квадратах. Нормальна кiлькiсть лейкоцитiв у дорослоi людини коливас- ться в межах 4500-10000 в 1 куб.мм. 2.4 МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ ДИФЕНРЕНЦIЙОВАНОI ФОРМУЛИ ЛЕЙКОЦИТIВ. Визначення загальноi кiлькостi бiлих кров яних тiлець, дас уяву проiх абсолютну кiлькiсть.
Але не дас вiдомостей про процентне спiввiдношення диференцiйовану формулу мiж рiзними видами лейкоцитiв i про якiснi змiни в iх морфологii при хворобливих станах. Визначення диференцiйованоi формули проводиться на фар- бованому мазку кровi.
Диференцiйована формула характерно змiнгюсться при рядi хворобливих станiв i мас надзвичайно важливе дiагностичне i прогностичне значення.
Нормальна диференцiйована формула дорослоi людини нас- тупна молодi нейтрофiльнi клiжтини - 0 паличкоядернi нейтрофiльнi клiтини - 0-4 сегментоядернi нейтрофiльнi клiтини - 55-70 лiмфоцити - 20-40 моноцити - 2-6 еозинофiльнi клiтини - 1-4 базофiльнi клiтини - 0-1 плазматичнi клiтини - 0-5 ВИГОТОВЛЕННЯ МАЗКА КРОВI. 1.Необхiдною умовою для правильного пiдрахунку морфо- логiчних особивостей кров яних клiтин являсться вда- лозроблений i добре забарвлений кров яний мазок.
Добре зроблений мазок кровi повинен вiдповiдати наступ- ним умовам а починасться на 1 см. вiд вузького краю предметного скла i закiнчусться на 2-3 см. вiд його другого краю. Загальна довжина мазка повинна охоплювати 1 2 - 3 4 скла. б мазок повине бути рiвномiрноi товщини, а не хвили- подiбний.
Правельний мазок кровi товщий на початку, поступо- во тоншас i закiнчусться у виглядi слiду, мов би залишеного тонкою щiточкою. в мазок повинен бути вiдокремленим вiд краю. Шар кровi не повинен доходити до другогоь краю скла. Приготування мазкiв проводиться слiдуючим чином пред- метне скло, на якому буде зроблено мазок, беруть за один кiнець великим i вказiвним пальцями правоi руки. Другий кiнець, вiдступаючи на 1 см. вiд краю, обережно дотикасться до свiжоiкраплi капiлярноi кровiiз пальця, нi в якому разi не торкаючись шкiри в мiсцi проколу.
Крапля кровi перехо- дить на скло, вона повинна мати дiаметр 2-3 мм. Предметне скло перекладають у лiву руку взявши його ве- ликим вказiвним i середнiм пальцямитак, щоб крапля знаходил ась зверху на предметному склi, з боку вказiвного i серед- нього пальцiв.
Шлiфоване скло, яким буде зроблено мазок вставлясться пiд кутом 40-45 на 1-2 мм перд краплею, придержуючи великим i вказiвним пальцями правоi руки край шлiфованого скла i обидва краi предметного скла. Шлiфоване скло рухають назад так, щоб воно торкалося кровi i крапля поширювалася в кутi мiж шлiфованим i предметним склом. потiм швидким рухом ру- хаючи скло в зв оротньому напрямку роблять мазок.
Протягом того часу коли робиться мазок, великий iвказiвний пальцi правоi руки ковзають по краях предметного скла i тим створюють необхiдну опору для накладання шару кровi. ФАРБУВАННЯ КРОВ ЯНОГО МАЗКА. Для якiсного дослiдження морфологii кров яних клiтин- фарбування кров яного мазка мас важливе значення.
Основу су- часного фарбування кров яних клiтин поклав петербуржський лiкар Д.Л.Романовсьий. В 1891 роцi вiн запропонував свiй барвник. В 1902 роцi Гiмза вдосконалив барвник Романовського. Барвник Романовського-Гiмза складасться з лужноi i кис- лоi частини. Лужна частина - азур 2, А кисла частина - еозин. Азур 2 забарвлений в яскраво-синiй колiр, а еозин в роже- во-червоний. Щоб приготувати основний розчин барвника розчиняють 30 г. азуру 2-еозину i 0,8г. азуру 2 в 250 мл. глiцерину, наг- рiваючи прицьому 90-120 хв. при 50 С, а потiм додають 250мл. чистого метилового спирту.
Пiсля вiдстоювання протягом 1-7 днiв при кiмнатнiй температурi фiльтрують. ФIКСАЦIЯ КРОВ ЯНОГО МАЗКА. Перед фарбуванням мазок кровi фiльтрують. Це робиться для денатурацii бiлкiв у клiтинах, при збереженнi iхжиттсвоi структури iж для закрiплення клiтин на предметному склi. Для фiксацii використовусться абсолютний метиловий алкоголь. Час фiксацii - 3-5 хв. Перед роботою, пiсля фiксацii, препарат заливають робо- чим розчином розведеним барвника Романовського-Гiмза. I залишають на 20-40 хв. Потiм його промивають, сушать, див- ляться пiд мiкроскопом.
ПIДРАХУНОК ДИФЕРЕНЦIЙОВАНОI ФОРМУЛИ. Кров янi клiтини не розподiляються рiвномiрно повсьому препратi. На початку i в кiнцi мазка вiдкладасться бiльшiсть великих клiтин з малою питомою вагою моноцити, гранулоцити, а в серединi - бiльшiсть малих клiтин, з вели- кою питомою вагою лiмфоцити. Порiвняно найбiльш правильне спiввiдношення складасться на дiлянках показаних на малюнку Тому саме на них проводиться диференцiйований пiдрахунок кров яних тiлець.
Пiдрахунок робиться у виглядi меандрiв, щоб уникнути повторення одних i тих же клiтин. Пiдраховують не менше 25 клiтин краще по 100 в 4-х дiлянках вказаних на малюнку. РЕзультат виражають в. Замiсть 4-х малих меандрiв, можна без грубоi помилки, описати 2 великих меандри, тобто злити 2 малих поля вiдцен- тру з обох сторiн в одне велике, не роблячи розриву в сере- динi. В такому разi в кожному з обох великих полiв пiдрахо- вують мiнiмально по 50 клiтин краще по 100 i результат ви- ражають в. Для полегшення розрахункiв використовують еле- ментарнi механiчнi лiчильнi машини. 2.5