Подготовка эритроцитов

Подготовка эритроцитов. Свежую гепаринизированную кровь разливали в центрифужные пробирки по 5 мл. После пятнадцатиминутного центрифугирования при 3000 обмин при 40 С отбирались и отбрасывались лейкоцитарный слой и плазма. Эритроциты суспендировали в десятикратном объме 0.9 раствора NaCl и центрифугировали в течение пятнадцати минут при 3000 обмин.

Супернатант отсасывали, процедуру повторяли 3 раза. Это делалось для более плотной упаковки эритроцитов. 2.2. Метод раздельного определения аскорбиновой, дегидроаскорбиновой и дикетогулоновой кислот в эритроцитах Для количественных определений АК, ДАК и ДКГК использовали метод J.H. Roe, C.A. Kuether 1943 в модификации В.В. Соколовского, Л.В. Лебедевой, Т.Б. Лиэлуп 1967. Метод основан на взаимодействии 2,4- динитрофенилгидразина с ДАК с образованием в серной кислоте соответствующего озазона.

ДАК и ДКГК дают красное окрашивание, используемое для фотометрического определения. Для вычисления суммы всех кислот их окисляют 2,6- дихлорфенолиндофенолятом натрия. Содержание АК определяют по разности. Для дифференцированного определения ДАК и ДКГК смесь подвергают действию восстановителей, при этом в АК восстанавливается только ДАК. В качестве восстановителя использовали димеркаптопропансульфонат натрия унитиол Реактивы 1. 2.10 М унитиол 0.84 мл 5 раствора ампулированного препарат в 100 мл 0.2 М фосфатного буфера рН 7.0. хранить не более суток. 2. 5 трихлоруксусная кислота ТХУ. Хранить в холодильнике не более двух недель. 3. 85 раствор серной кислоты 100 мл воды 900 мл концентрированной серной кислоты. 4. 2 раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 9Н серной кислоте, содержащей 0.25 тиомочевины хранить в холодильнике не более 1 месяца. 5. 0.001 Н раствор 2,6- дихлорфенолиндофенолята натрия краска Тильманса.

Хранить в темноте не более 1 недели. 6. 0.9 раствор хлорида натрия физиологический раствор.

Ход определения. В три пробирки помещали по 0.5 мл упакованных и отмытых от плазмы эритроцитов с известным гематокритом. В первую прибавляли 0.25 мл физиологического раствора и 0.25 мл унитиола. После пятнадцатиминутной инкубации при периодическом помешивании суспензии отбирали 0.5 мл экстракта, к которому прибавляли 1.5 мл ТХУ. В две другие пробирки также прибавляли по 1.5 мл ТХУ. В две пробирки вносили по 0.75 мл супернатанта, полученного при центрифугировании смеси упакованных эритроцитов с ТХУ. В одну из пробирок добавляли по каплям 0.001 Н раствор 2,6- дихлорфенолиндофенолята натрия до появления слаборозового окрашивания, устойчивого в течение 30 секунд.

В третью пробирку помещали 0.75 мл супернатанта, полученного после центрифугирования смеси упакованных эритроцитов с физиологическим раствором, унитиолом и ТХУ. Во все пробирки добавляли по 0.25 мл 2,4- динитрофенилгидразина и доводили объм до 1.25 мл дистиллированной водой, инкубировали при 100 0 С в течение 10 минут и охлаждали в ледяной бане. В каждую пробирку добавляли небольшими порциями 1.25 мл 85 раствора серной кислоты, охлаждая в ледяной бане после каждой порции.

Окрашенные растворы фотометрировали через час при длине волны 540 нм. Концентрацию кислот определяли по формуле С 3А0.085 где С концентрация кислот, мг 3 концентрация стандартного раствора, мг А оптическая плотность пробы 0.085 оптическая плотность стандартного раствора 2.3.