ПРИНЦИПЫ ТЕХНОЛОГИЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК. Было выделено много рестриктазболее 150,расщепляющих ДНК в специфических сайтах. Например эндонуклеаза R1 регистрирует двухцепочную ДНК по двум сайтам таким образом, что образуются два липких конца G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G Липкие концы различных молекул ДНК, расщеплнных этим ферментом, могут вступать по четырм A-T-парам.
Рестриктационные эндонуклеазы различаются по тем сайтам ДНК, которые они распознают и разрезают. Их можно использовать для различных целей. Однако наиболее распространенным этапом является их применение для амплификации специфической определения нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, необходимо для ДНК или для изучения механизмов экспрессии генов.
Последняя проблема наиболее важна в практическом аспекте гены контролирующие образование функционально активных белков, теперьможно вводить в бактерии и размножатьамплифицировать.эта процедура называется клонированием генов. Благодаря ей, появилась возможность вырабатывать в больших количествах белки, которые раньше удавалось получить ничтожно мало. Эта технология основана на следующем принцепе помимо своей собственной кольцевой хромосомы, бактерии часто содержат дополнительные маленькие кольцевидные молекулы двух цепочной ДНК,называемые плазмидами.
Плазмиды реплицируются автономо и сами могут содержать гены, определяющие устойчивость бактерий к антибиотикам или контролирующие синтез веществ, например колицинов, убивающих другие бактериисм. рис.1. Плазмидную ДНК можно выделить и ращепить подходящей рестриктазой только в одном сайте, превратив кольцевую молекулу в линейную с липкими концами. Фрагменты любой чужеродной ДНК с такими же липкими концамиполученными после разрезания аналогичной рестриктазой можно сшить с плазмидой ДНК с помощью лигазы.
Рис. 1. Клетка E-coli с хромосомой и плазмидой. Рекомбинантную конструкцию вводят затем в бактерию, где она реплицируется см. рис.2 Рис. 2. Принцип введения чужеродной ДНК в бактериальную плазмиду с использованием эндонуклеазы. Источник экзогенной ДНК не имеет значения. ДНК может быть получена, например, из клеток человека, но можно сшивать и искуственно синтизированные гены. Кроме бактериальных плазмид в качестве векторов носителей ДНК используют фаги объект исследования Альберта.
Часть генома этого фага не обязательна для его размножения в бактерии. Вместо него можно ввести чужеродную ДНК, которая будет размножаться вместе с фаговой, после инфицирования бактерий. Добиться репликации и амплификации в составе плазмидной или фаговой ДНК после трансформации бактериальной клетки ещ не значит решить все е проблемы. Прежде всего возникают два вопроса 1. Как распознавать клоны, содержащие гибридную ДНК, среди потомства трансформированных клеток или живых бактериофагов 1. как идентифицировать необходимые фрагменты ДНК среди многих кл онированных неизвестных фрагментов Например можно отбирать бактериальные клетки, если они несут плазмиду с фактором устойчивости к антибиотику, выращивая их на среде, на среде, содержащей антибиотик.
Нетрансформированные клетки без плазмиди, следовательно, без гена устойчивости к антибиотику просто не будут расти на такой среде. В последнее время разработано много специальных методов вакцинации, которые позволяют отбирать только рекомбинантные клетки.
Для генной инженерии белков недостаточно отобрать и размножить определнные фрагменты ДНК, необходимо ещ индуцировать их экспрессию в клетке. Для этого необходимо подключить рекомбинантную молекулу ДНК , последующую трансляцию матричной РНК и процессинг как на транскрипционном, так и на трансляционных уровнях. 1.4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ГЕНОВ. Ещ одна область применения рестриктаз идентификация и определение числа генов.
Эти задачи решаются с помощью метода разработанного Саузерном. Тотальную ДНК из клеток человека гидролизуют эндонуклеазой примерно на 50 фрагментов длиной от 102 до 105 нуклеотидных пар. Затем фрагменты разделяют по молекулярной массе с помощью гель- электрофореза в ага розе, после чего ДНК денатурирует с щелочью прямо в геле, чтобы получить одноцепочные фрагменты. Их переносят на нитроцеллюлозный фильтр и фиксируют высушиванием при 800С. В результате получается отпечатокреплика картины разделения фрагментов ДНК по их размеру.
Эти фрагменты можно идентифицировать методом гибридизации с радиоактивными ДНК-зондами, специфичными для определнных генов или хромосом. Любой фрагмент, содержащий всю последовательность зондируемого гена или его часть, будет выглядеть на радиоавтографе в виде тмной полосы. Зонды и генные библиотеки. Главное условие такого анализа - наличие подходящего геноспецифического радиоактивного ДНК-зонда, который можно использовать для гибридизации. 1.5.