Избранные материалы из статьи на тему Характеристика некоторых представителей углеводородокисляющей микрофлоры Усинского нефтяного месторождения автора к.б.н. М. Маркаровой

Избранные материалы из статьи на тему Характеристика некоторых представителей углеводородокисляющей микрофлоры Усинского нефтяного месторождения автора к.б.н. М. Маркаровой. При разложении органических загрязнений, попадающих в окружающую среду, ведущая роль принадлежит микроорганизмам.

Основными объектами наших исследований были нефтезагрязненные почвы и микрофлора Усиниского нефтяного месторождения.

В течение ряда лет мы проводили сравнительный анализ состава и численности микрофлоры нефте-загрязненных почв на разных сроках загрязнения.

Для свежезагрязненных почв характерна высокая численность почвенных микроорганизмов общий титр КОИ в почве 3-8-106-7 , преобладание группы аммонификаторов над другими трофическими группами, представленной мелкими однообразными бесцветными колониями бактерий родов Pseudomonas и Arthrobacter табл. 1 . Пигментированные колонии рода Rhodococcus, характеризующиеся, как правило, высокой степенью ферментативной активности- единичны.

В отличие от свежезагрязненной почвы на более поздних срезках после загрязнения нефтью в почвах увеличивается численность групп олиготрофной микрофлоры, олигонитрофилов и целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Общая численность остается по-прежнему высокой 10 6-7 , Преобладающими видами среди бактерий являются представители родов Rhodococcus и Pseudomonas, относительно высока численность родов Arthrobacter, Flavobacterium, Agrobacterium.

Отмечено присутствие грибов родов Mucor, Penicillium и Trichoderma встречающихся также и в незагрязненной почве. Таблица 1 Представители доминирующих родов микроорганизмов в нефтезагрязненных и незагрязненных почвах Усинского района Фоновая почва Свежезагрязненная нефтью почва срок загрязнения до трех лет Почва старых нефтяных разливов срок загрязнения более восьми лет Criptococcus Arthrobacter Arthrobacter Bacillus Pseudomonas Pseudomonas Mycobaclerium Pmicillium Rhodococcus Anhtohacter Aspergillius Penicillium Pseudomonas Mucor Rhodococcus Trichoderma Penicillium Flavobacterium Chrisosporium Agrobacterium Mucor Candida Rhodolorula Clostridium преобладающие по численности представители почвенной микрофлоры.

Фоновые почвы отличаются от загрязненных нефтью не только более богатым видовым составом табл. 1 , но и меньшей численностью.

Преобладающими по численности в них были виды родов Criptococcus, Bacillus, Arthrobacter, Chrisosporium, Rhodotorula численность более 105 клеток 1 г в.с.п Многочисленны численность около 104 клеток в 1 г в.с.п. представители родов Mycobaclerium, Penicillium, Candida, Mucor, Clostridium.

Также в фоновых почвах представлены и углеводородокисляющие виды родов Pseudomonas и Rhodococcus, но они не являются доминирующими, по сравнению с загрязненными нефтью почвами численность не превышает 1000 клеток на 1 г в.с.п Таким образом, при нефтяном загрязнении в почвах происходит резкое увеличение численности микрофлоры узкоспециализированных групп бактерий, подавление большинства аборигенных видов, в том числе и микроскопических грибов.

Высокая численность почвенных бактерий и бедный их видовой состав сохраняются в условиях Севера на протяжении трех-пяти лет после нефтяного загрязнения, что совпадает с периодом очищения почвы от подвижных растворимых и летучих углеводородов.

Последующее очищение почв от нефти происходит с участием различных видов, таких, которые обладают либо выраженной углеводородокисляющей активностью или выделяют в окружающую среду биологически активные вещества виды с высокой степенью ферментативной активности, либо участвуют в процессах трансформации промежуточных соединений или резистентны к присутствию остаточных углеводородов.

Дальнейшее исследование было сосредоточено на нескольких направлениях. Одним из них стало изучение физиолого-биохимических свойств углеводородокисляющей бактериальной микрофлоры нефтезагрязненных почв Усинского района, с целью составления коллекции культур алканотрофной психрофильной микрофлоры. Выделенные в чистую культуру виды табл. 2 стали основой для создания препарата МУС-1, предназначенного для активизации разложения нефти в почвах Усинского района.

Ими являются Ahrtrobacter sp Pseudomonas alcaligenes, Rhodococcus erythropolis, Flavobactenuin barbe и Agrobuctenum sp. Все изучаемые виды табл. 2 способны активно развиваться в присутствии как аммонийного КАА , так и нитратного азота на среде Чапека. Денитрифи-цирующей способностью обладают все перечисленные виды, кроме флавобактерий. Характерной особенностью выделенных бактерий рода Pseudomonas является способность восстанавливать нитраты NО3 до газообразного азота N2 .Bce это свидетельствуют о том, что типичные для нефтезагрязненных почв Усинского месторождения микроорганизмы способны развиваться как в аэробных, так и в частично анаэробных условиях, в последнем случае переходить на нитратное дыхание.

Это важно с точки зрения условий, в которых развиваются процессы самоочищения почв после воздействия нефтяных загрязнений. Речь идет об одном из следствий нефтяного загрязнения - ухудшении воздушных условий в почве, что является важной причиной ингибирования жизнедеятельности микроорганизмов.

Способность к нитратному дыханию в этом случае является одним из способов приспособления к неблагоприятным условиям. На МПБ активность культур менее высокая, чем на КАА и среде Чапека. Существенно она снижается на МПБ в присутствии NaCI. Рост на средах с глюкозой и сахарозой существенно не различается. Все это позволяет отнести данные виды к группе аммонификаторов-гетеротрофов.

Известно, что многие углеводородокисляющие микроорганизмы могут стимулировать уреазную активность почвы. Этот показатель используется часто для оценки экологического состояния нефте-загрязненных почв, для которых характерно увеличение уреазы на 15-25 по сравнению с незагрязненными почвами. Среди изучаемых культур оксидазную активность проявляли только представитель рода Pseudomonas. Уреазную активность проявляли все культуры, кроме псевдомонад, наиболее заметно эти показатели были выражены у Rhodococcus.

Изучение роста чистых культур и комплекса видов из этих культур на сырой нефти показало, что каждый из представленных видов способен изменять качественные характеристики сырой нефти за счет деструкции отдельных ее составляющих. Деструкция углеводородной фракции отдельными культурами была незначительна и составила от 7 Rhodococcus erythropolis до 16 Agrobactenum radiobacter процентов по сравнению с контролем табл. 3 . Деструкция н-алканов отдельными культурами также отличается.

В культуре Rhodococcus erythropolis произошло уменьшение массовой доли соединений с длиной цепи С16-18, С22-24, С26-31, с образованием промежуточных соединений с длиной цепи С11-14. Под воздействием Pseudomonas alcaligenes н-алканы подверглись заметному разложению в диапазоне от С14 до С30. При этом масса углеводородов с длиной цепи менее 10 атомов углерода заметно увеличилась, что свидетельствовало о возрастании в составе остаточной нефти доли углеводородов с низким молекулярным весом табл. 3 . В варианте с культурой Flavobacterium barbe наблюдалось более заметное, чем в предыдущих культурах, изменение хроматографического рисунка н-алканов, характеризующееся снижением массовой доли соединений с длиной цепи С14-21 и увеличением доли соединений в диапазоне С25 и С30, по-видимому, за счет разложения более сложных углеводородов и длиной цепи С17-30 происходило заметное увеличение доли соединений от С13 до С15. При этом увеличился и вес легких углеводородов табл. 3 . Agrobacterium radiobacter способствовал относительно резкому, по сравнению с рассмотренными выше культурами снижению доли тяжелых парафинов с длиной цепи более С22. Таблица 3 Изменение массы отдельных фракций нефти под влиянием изучаемых культур Вариант Масса нефти, г Масса гетероциклических соединений, г Масса углеводородной фракции, г Парафины с длиной цепи до 10 атомов углерода, г Общая степень деструкции, Контроль 5 0,925 3,857 0,218 0,00 Rhodococcus erythropolis 4,519 0,591 3,591 0,216 9,62 Pseudomonas alcaligenes 4,45 0,594 3,407 0,299 11,0 Plavobaclerium barbe 4,60 0,652 3,809 0,089 8,0 Arthrobacter sp. 4,48 0,594 3,537 0,225 10,4 Agrobacterium radiobacter 4,10 0,538 3,237 0,209 18 МУС-1 1,33 0,371 0,943 0,01 73,4 Эффективность разложения нефти в комплексе превышала суммарный эффект монокультур и составляла 73-75 , при этом доля в составе нефти гетероциклических соединений снижалась на 60 , углеводородов - на 75-76 табл. 3 . Разложение алканов произошло по всему спектру соединений, в том числе и высокомолекулярных.

Очевидно, что такое резкое отличие углеводородокисляющей активности комплекса по сравнению с монокультурами связано с трофическим взаимовлиянием культур, т.е. способностью каждой из них разлагать промежуточные соединения, новообразованные при деструкции углеводородов другими культурами.

Отличия в качественном разложении н-алкановой фракции чистыми культурами в какой-то степени свидетельствуют в пользу сказанного.

К настоящему времени в чистую культуру из нефтезагрязненных почв Усинского района выделено более 50 штаммов различных углеводородокисляющих бактерий.

Как известно из литературы, природных штаммов, способных разлагать сразу все виды соединений, входящие в состав сырых нефтей, не существует.

Изучение отдельных представителей углеводородокисляющей микрофлоры, специфики роста их на углеводородах нефти позволяет моделировать составы препаратов для конкретного состава нефти. Данные, приведенные в настоящей статье являются начальными в цепочке исследований для создания рабочей коллекции культур алканотрофных бактерий почв Севера.

Избранные материалы из публикации Мукашева Т.Д. и Шигаева М.Х. на тему МИКРООРГАНИЗМЫ В ПОЧВАХ КАЗАХСТАНА С РАЗНОЙ СТЕПЕНЬЮ ЗАГРЯЗНЕНИЯ НЕФТЬЮ . Целью данной работы явилось изучения отклика микроорганизмов в почвах Атырауской области на различные концентрации загрязнителя - нефти. Объектами исследования были нефтезагрязненные почвы различных месторождений Атырауской области на участках с интенсивным нефтяным загрязнением от 3256 мг кг до 5877 мг кг почвы и в местах визуально не загрязненных от 359 мг кг до 125 мг кг почвы. Почвенные образцы для исследования брали на глубине 0-10 см и 10-20 см. Для слабозагрязненных почв характерна высокая численность почвенных микроорганизмов общий титр КОЕ в почве, 106-107 преобладание группы аммонификаторов над другими трофическими группами, представленной разнообразными бесцветными колониями бактерий родов Pseudomonas и Bacillus табл.1 . Пигментированные колонии рода Rhodococcus, характеризующиеся, как правило, высокой степенью ферментативной активности - единичны.

В отличие от слабозагрязненной почвы в сильнозагрязненых нефтью почвах общая численность уменьшается на два- три порядка, преобладающими видами среди бактерий являются представители родов Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus и Mycobacterium.

Кроме того, численность групп олиготрофных микроорганизмов 10 5-6 в сильнозагрязненной почве месторождений Доссор и Тенгиз выше, чем количество гетеротрофных групп на два-три порядка 10 3-4 . В слабозагрязненных почвах относительно высока численность красных колонии дрожжей рода Rhodotorula.

Отмечено их отсутствие в сильнозагрязненных почвах месторождения Доссор и Тенгиз. Преобладающими видами среди дрожжевых организмов в этих почвах являются представители родов Candida и Trichosporon. При слабом нефтяном загрязнении в почвах происходит резкое увеличение численности узкоспециализированных групп бактерий - углеводороокисляющих бактерий, отмечено присутствие в таких почвах мелких однообразных бесцветных колоний.

В сильнозагрязненных почвах колебания численности углеводороокисляющих бактерий были более значительны 102-104 и преобладали бактерий, образующие мелкие пигментированные колонии. Таблица 1. Численность гетеротрофных микроорганизмов в нефтезагрязненных почвах. Месторождение-количество нефти в почве мг кг Численность микроорганизмов, млн. г почвы КОЕ Гетеротрофных бактерий Олигот рофные Актино мицеты дрожжи и грибы углеводород окисляющие аммоницирующие спорообразующие слабозагрязненные почвы Доссор- 359 Забурунье- 125 Бекбике- 159 Тенгиз- 143 1 2 1 2 1 2 1 2 43,1 24,3 98,6 56,4 83,8 54,2 71,9 63,5 0,52 0,28 0,38 0,23 0,56 0,35 0,31 0,43 6,4 2,8 4,8 1,9 7,1 5,9 4,6 2,5 0,63 0,77 0,75 0,57 0,63 0,77 0,75 0,57 3,9 2,5 1,2 3,5 2,5 5,2 2,8 4,3 32,7 45,2 32,4 23,1 32,4 45,9 32,2 23,5 Сильнозагрязненные Доссор 5877 Забурунье 3256 Бекбике 3568 Тенгиз 4582 3 4 3 4 3 4 3 4 0,37 0,025 8,4 7,2 3,5 3,5 0,34 0,12 0,0091 0,017 0,26 0,22 0,29 0,59 0,046 0,62 2,32 0,47 2,6 1,9 6,1 1,8 4,54 1,32 0,0036 0,023 0,028 0,022 0,036 0,023 0,028 0,022 0,0032 0,027 0,039 0,031 0,032 0,027 0,039 0,031 0,32 0,027 3,9 3,1 3,2 2,7 3,9 0,31 Примечание 1,3 - пробы почв взяты с поверхности 0-10см 2,4 - пробы почв взяты с глубиной 10-20 см 1,2 пробы почв слабозагрязненных нефтью 3,4 пробы почв сильнозагрязненных нефтью.

Выделенные штаммы были группированы на основании ряда морфо-физиологических свойств.

Морфологии колонии и вегетативных клеток форма, подвижность, наличие спор, окрашивание по Граму, способность к росту в присутствии аммонийного и нитратного азота, денитрифицирующей, оксидазной и уреазной актиностей.

По морфологии колонии все выделенные культуры были разделены на группы группа 1 - бактерии, образующие неокрашенные колонии белые группа 2 - бактерий, пигментированные колонии, кремовые группа 3 - бактерий, пигментированные колонии, красно-розовые морфотип 4 - бактерий, колонии морщинистые кремовые.

Среди изучаемых культур, большинство относились к грамотрицательным микроорганизмам, обладали денитрифицирующей и оксидазной активностями и были выделены из слабозагрязненных почв. Из сильнозагрязненных почв культуры, проявляющие оксидазную активность, представлены незначительно. Уреазную активность проявили большинство грамположительных штаммов, которые были выделены из сильнозагрязненных почв. Известно, что нефтеокисляющие микроорганизмы могут стимулировать уреазную активность почвы и этот показатель многие исследователи используют для оценки экологического состояния нефтезагрязненных почв. Таким образом, на численность микроорганизмов и на количество доминантных видов в нефтезагрязненых почвах оказывает воздействие степень загрязнения, кроме того, в сильнозагрязненных почвах наблюдается спад микробного разнообразия.