Использование хищного гриба Duddingtonia flagrans против нематод

Использование хищного гриба Duddingtonia flagrans против нематод. Организация промышленного производства биомассы хищного гриба Duddingtonia flagrans и использование полученного препарата против нематод позволит получить большой экономический эффект при выращивании различных сельскохозяйственных культур. Теплякова Т.В Кислых В.И Ананько Г.Г Ибрагимова Ж.Б. ГНЦ ВБ «Вектор» Фитопаразитические нематоды, относящиеся к типу круглых червей, наносят существенный ущерб урожаю.

Мировые потери только сельскохозяйственной продукции от нематод составляют в среднем 7-10%. В нашей стране ощутимый ущерб сельскому хозяйству наносят овсяная, картофельная, свекловичная, галловые и другие нематоды. В теплицах галловые нематоды могут вызывать до 50% потерь продукции томатов. Хищные грибы (нематофаги), обитающие в почве, являются природными регуляторами численности нематод.

Периоды с неблагоприятными условиями для роста грибы переживают в форме конидий и хламидоспор Рис.12 Конидии и хламидоспоры гриба Duddingtonia flagrans (Х20) Гифы хищных грибов образуют различные улавливающие приспособления, в которых идет синтез биологически активных соединений – аттрактантов (веществ, привлекающих нематод), токсинов, ферментов, участвующих в механизме хищничества. Ловушки в форме клейких петель и их сплетений (рис.13) позволяют хищным грибам улавливать нематод и переваривать их содержимое (рис.14). Хищные грибы найдены практически во всех частях мира, Это свидетельствует об их большой экологической роли в утилизации огромной массы нематод в почве, многие из которых являются возбудителями заболеваний растений и животных и причиняют большой экономический ущерб растениеводству и животноводству.

Рис.13 Ловчие петли и кольца нематофаговых грибов Рис.14.Нематода в клейких сетях гриба рода Arthrobotrys (10 х 20) Предпринятый нами поиск эффективных хищных грибов позволил отобрать в природных популяциях два штамма из родов Arthrobotrys и Duddingtonia, характеризующихся высокими показателями нематофаговой активности.

Применение грибного биопрепарата против галловых нематод в теплицах способствует повышению урожая огурца и томата до 2-х кг/м2 (1,2). В условиях промышленного производства получение жидкой формы биопрепарата экономически выгодно и экологически целесообразно. По данным патентного анализа, глубинное культивирование грибов по сравнению с их выращиванием на твердых субстратах является более технологичным, операции легче стандартизируются, значительно повышается производительность.

Процесс глубинного культивирования мицелиальных грибов отличается «тяжелыми» реологическими характеристиками культуральной среды в связи с наличием в среде агломератов мицелия. Мицелий состоит из последовательно соединенных клеток гриба, образующих длинные нити, которые в процессе роста сплетаются в комки различных размеров.

Эта особенность приводит к существенному искажению микрокинетических и макрокинетических закономерностей процесса в реальных условиях культивирования. Кроме того, мицелиальные грибы, по сравнению с бактериальными клетками, более чувствительны к механическим воздействиям при технической реализации процесса суспензионного культивирования. Основным условием управляемого культивирования мицелиальных грибов является возможность гомогенного распределения мицелия по всему объему питательной среды биореактора и создание в каждой его точке оптимальных условий для роста биомассы.

В биореакторе с механической мешалкой мицелий часто травмируется лопастями мешалки. Кроме того, комки и агломераты мицелия прирастают к внутренним поверхностям биореактора и затрудняют транспорт питательной среды к культуре и отток продуктов метаболизма. В результате рост мицелия в комках существенно тормозится, а в центре крупных комков происходит лизис клеток. Исходя из вышеизложенного для культивирование гриба D. flagrans был использован наиболее подходящий, на наш взгляд, тип аппарата – газовихревой безградиентный биореактор «БИОК» рабочим объемом до 5 л, оборудованный стерилизуемыми датчиками температуры, рН, рО2 и электронной системой контроля и управления основными параметрами процесса роста.

Объекты и методы исследования Засев биореактора производили 2-х суточной культурой штамма Daddingtonia flagrans F-882, выращенной в колбах на качалке, в соотношении 1:10 (400 мл посевной культуры на 4 л питательной среды). В ходе экспериментов контролировали следующие параметры: скорость вращения активатора, интенсивность аэрации, содержание кислорода в питательной среде, рН, температуру, интенсивность пенообразования.

Содержание сухой биомассы в культуре определяли весовым методом на фильтрах. По показаниям приборов оценивали динамику роста и потребления питательных веществ. Использовали ранее подобранную жидкую питательную среду следующего состава (г/л): KH2PO4 – 5, MgSO4 (б/в) – 2, NaNO3 – 5, кукурузный экстракт – 7,5, меласса – 30, вода водопроводная – до1л. рН доводили до значения 6,8 и стерилизовали автоклавированием.

Изучение морфологических и цитологических особенностей культуры изучали на временных препаратах, используя краситель нейтральный красный в разведении 1:10000. Препараты просматривали под микроскопом Yenaval (фирма Zeiss, Германия), делали зарисовки и фотографии. Основные результаты исследования и обсуждение В ходе проведенных исследований были подобраны оптимальные условия культивирования мицелия гриба D. flagrans F-882. При их соблюдении посевной мицелий начинает расти практически сразу и за первые сутки концентрация биомассы увеличивается в 11 раз. Если доза посевного мицелия недостаточна либо его рН существенно отличается от рН питательной среды в биореакторе, наблюдается продолжительная лаг-фаза и для получения готовой биомассы требуется не менее 7 суток.

Скорость прироста биомассы также существенно зависит от интенсивности массообмена, обеспечиваемого перемешиванием среды.

В ходе исследований были подобраны следующие параметры процесса ращения биомассы гриба D. flagrans: температура процесса +280C; рН в интервале 6,5 – 7,0; объем питательной среды – 4 литра; расход воздуха, подаваемого через барботер – 8 л/мин, что обеспечивает оптимальное содержание кислорода в среде, равное 70 – 80%; скорость вращения активатора – 2400 об./мин. В данных условиях содержание биомассы по сухому веществу за 4 суток достигает максимального значения 12 г/л. По внешнему виду готовый продукт выглядит подобно студню с высокой вязкостью.

В этот период при окраске нейтральным красным в гифах наблюдается много крупных гранул. Появление таких гранул при окрашивании клеток раствором нейтрального красного свидетельствует о накоплении ненасыщенных соединений (3), к которым относятся и биологически активные вещества, принимающие участие в акте хищничества (аттрактанты, клей, токсины). Полученная культура проявляет высокий аттрактивный и нематофаговый эффект.

При изучении морфологических (цитологических) показателей готовности биомассы установлено, что в развитии гриба D.flagrans c 4-х суток на мицелии наблюдается образование утолщений, а также спиралевидных кончиков гиф.(рис.15) Рис. 15. Морфологические особенности гриба D. flagrans при ферментации в безградиентном газо-вихревом биореакторе «БИОК»: спиралевидные кончики гиф, как показатель зрелости культуры. Полученный продукт соответствует требованиям, предъявляемым концентрату биомассы гриба, и может быть использован для получения товарной формы препарата. При использовании биопрепарата на основе нематофаговых грибов урожай огурцов увеличивается до 2-х кг на 1 кв.м, а пораженность растений галловыми нематодами снижается на 86-90%. Заключение Биологические методы борьбы с сельхозвредителями являются наиболее экологичными и весьма эффективными.

Организация промышленного производства биомассы хищного гриба Duddingtonia flagrans и использование полученного препарата против нематод позволит получить большой экономический эффект при выращивании различных сельскохозяйственных культур Для промышленного производства препаратов на основе хищного гриба Duddingtonia flagrans необходимо использовать оптимальные варианты биореакторов, обеспечивающие щадящие (мягкие) условиях перемешивания микроорганизмов, создание оптимальных условий аэрации и хорошую продуктивность процесса культивирования даже при высокой вязкости культуральной среды. Наиболее подходящими для этого процесса на наш взгляд являются газовихревые безградиентные биоракторы