Кодирование и организация вирусного генома. Вирусные гены кодированы либо в РНК, либо в ДНК, кото¬рые могут быть либо одно либо двухцепочечными.
Кроме того, геномы могут быть либо монолитными, когда все гены вируса содержатся в одной хромосоме, либо состоять из раздельных блоков, когда все гены вируса распределены среди нескольких хромосом, которые все вместе и составляют геном вируса.
Во избежание ошибок мы обозначаем как «геномную» только нук¬леиновую кислоту, которая заключена в вирионах.
Среди РНК-содержащих вирусов реовирусы представляют собой наиболее хорошо изученное семейство, содержащее двухцепочечный геному кроме того, этот геном принадлежит к сегментированным, так как он состоит из 10 сегментов, или хромосом.
Геномы одноцепочечных РНК-содержащих вирусов могут быть либо монолит¬ными (пикорна-; тога парамиксо рабдо корона ретровиру-сы), либо сегментированными (ортомиксо арена- и буньявирусы). Все РНК-геномы относятся к линейным молекулам. Неко¬торые из них, например геномы пикорнавирусов, содержат на 5 конце РНК ковалентно связанные полипептиды или амино¬кислоты. Все известные ДНК-содержащие. вирусы, заражающие позво¬ночных, имеют монолитный геном. За исключением геномов пар-вовирусов, все они — полностью или частично — двухцепочечные.
Отдельные вирионы парвовирусов содержат линейную одноцепочечную ДНК; в некоторых родах (например, у аденоассоциированных вирусов) комплементарные цепи ДНК находятся в разных частицах. ДНК паповавирусов — кольцевая и сверх¬спиральная, в то время как ДНК герпесвирусов, аденовирусов, а также поксвирусов — линейная. ДНК вируса гепатита В пред¬ставляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу, на обеих цепях которой в разных областях обнаружены большой и ма¬лый одноцепочечные участки. Вирусы, содержащие одноцепочечную РНК Вирусы с одноцепочечной РНК можно подразделить на три группы.
В первую группу входят пикорнавирусы и тогавирусы. Их геномы выполняют две функции (рис.2 и 3). Во-первых, они функционируют как мРНК. Вирусы, геном которых может служить в качестве мРНК, принято называть вирусами с пози¬тивным геномом. РНК пикорнавирусов после проникновения в Рис.2. Размножение пикорнавирусов. Рис.3. Размножение тогавирусов. клетку связывается с рибосомами и полностью транслируется (рис. 5.2). Затем продукт этой трансляции — полипротеин — рас¬щепляется.
Во-вторых, геномные РНК выполняют функцию мат¬рицы для синтеза на ней комплементарных минус-цепей при уча¬стии полимеразы, появившейся в результате расщепления поли-протеина. На этих минус-цепях синтезируются новые плюс-цепи, которые могут использоваться в качестве: а) мРНК, б) матриц для синтеза новых минус-цепей в) составной части вирусных частиц потомства.
Тогавирусы и ряд других вирусов с позитивным геномом отличаются от пикорнавирусов в одном отношении (рис. 3): для трансляции в первом цикле синтеза белков доступна только часть их геномной РНК. Вероятной функцией образующихся при этом белков является способность транскрибировать геномную РНК. Они осуществляют синтез минус-цепи, которая в свою оче¬редь служит матрицей для синтеза двух различных по размеру классов молекул плюс-РНК. В клетках, зараженных тогавирусами, РНК первого класса представлены небольшими молеку¬лами мРНК, фланкирующими участок геномной РНК, который не транслировался в первом цикле.
Образующиеся на них поли¬протеины расщепляются на белки, которые играют структурную роль в вирионах. Плюс-РНК второго класса состоит из полнораз¬мерных цепей, которые упаковываются в вирионы. В клетках, зазаженных коронавирусами, синтезируются несколько видов мРНК. Главным в репликации вирусов с позитивным геномом являет¬ся способность геномной РНК служить в качестве мРНК после заражения.
Это имеет двоякие последствия. Во-первых, фермен¬ты, ответственные за репликацию генома, синтезируются после заражения, и нет необходимости в их внесении в зараженную клетку вместе с вирионом. Вот почему «голая» РНК, экстраги¬рованная из вирионов, инфекционна. Во-вторых, так как все позитивные геномы относятся к монолитным и все их гены со¬средоточены в одной хромосоме, первичный продукт трансляции обеих РНК (как геномной, так и мРНК) обязательно представ¬ляет собой единый белок.
Продукты трансляции пикорнавирусов и тогавирусов должны быть, затем расщеплены на индиви¬дуальные белки, которые и обнаруживаются в вирионе или в зараженной клетке. Ортомиксовирусы, парамиксовирусы, буньявирусы, аренавирусы и рабдовирусы составляют вторую группу одноцепочечных РНК-содержащих вирусов, называемых вирусами с негативным геномом. Для них характерно то, что геномная РНК выполняет две матричные функции: во-первых, для транскрипции и, во-вто¬рых, для репликации.
В связи с тем что для синтеза мРНК должен транскрибироваться вирусный геном, а в клетках соот¬ветствующие ферменты отсутствуют, все вирусы с негативным геномом содержат в вирионе кроме вирусного генома транскриптазу. Транскрипция вирусного генома — первое событие после проникновения вируса в клетку, в результате которого накапли-ваются функционально активные моноцистронные мРНК [пози¬тивные, или плюс-цепи], кодирующие один белок. Репликацию начинают новосинтезированные вирусные белки, катализирую¬щие образование полной плюс-цепи, которая служит матрицей для синтеза геномной минус-РНК (рис. 4). Главное в репликации вирусов с негативным геномом заклю¬чается в том, что геномная РНК функционирует как матрица и для транскрипции, и для репликации. Отсюда следует, что, во-первых, вирус должен внести с собой в зараженную клетку транскриптазу; во-вторых, «голая» РНК, экстрагированная из вирионов, неинфекционна; в-третьих, синтезируемые мРНК име¬ют длину одного гена, они кодируют один белок — единичный полипептид.
Однако присутствие сигналов сплайсинга в опреде¬ленных (не разбросанных произвольно по гену) участках может обеспечить формирование нескольких мРНК (каждая из кото¬рых кодирует особый белок) с одного и того же участка генома.
Следовательно, плюс-транскрипт, функционирующий в качестве Рис.4. Размножение ортомиксовирусов и парамиксовирусов. Рис.5. Размножение ретровирусов. мРНК, отличается от плюс-РНК, служащей матрицей для вирус¬ного потомства, хотя и первый, и вторая синтезируются на геномной РНК- Преимущества транскрипции многих мРНК о одного и того же участка (в результате сплайсинга) очевидны. Моноцистронная мРНК выгодна потому, что вирус при этом может контролировать относительные количества отдельных бел¬ков, и нет необходимости их синтеза в эквимолярных количест¬вах. Ретровирусы входят в третью группу РНК-содержащих ви¬русов (рис. 5). Характерно, что геномы ретровирусов монолит¬ны, но имеют диплоидную структуру, и обе цепи либо частично соединены водородными связями друг с другом, либо спарены неизвестным до настоящего времени образом.
Единственная из¬вестная функция геномной РНК — матричная функция для син-теза вирусной ДНК. Поскольку эукариотические клетки не име¬ют для этого соответствующих ферментов, вирион кроме генома содержит еще и РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу), а также смесь тРНК хозяина, одна из которых Рис.6. Размножение реовирусов. служит в качестве затравки.
В цикле репродукции можно выде¬лить следующие ключевые ступени: а) связывание комплекса тРНК —обратная транскриптаза с геномной РНК; б) синтез ДНК-копии, комплементарной по отношению к РНК, с переходом полимеразы с одной молекулы РНК-матрицы на другую, что приводит к образованию кольцевой одноцепочечной молекулы ДНК, связанной водородными связями с линейной геномной РНК; в) расщепление геномной РНК нуклеазой, атакующей только РНК в ДНК—РНК-гибридах (рибонуклеазой Н, также содержащейся в вирионе), г) синтез комплементарной копии вирусной ДНК. Затем кольцевая двухцепочечная ДНК переме¬щается в ядро, где интегрирует с геномом хозяина, но последую¬щая экспрессия вирусных генов не обязательна.
Если экспрес¬сия происходит, то интегрированная.вирусная ДНК транскриби-руется транскриптазой клетки-хозяина.
Продуктами транскрип¬ции являются молекулы РНК, как равные по длине молекуле генома, так и более короткие мРНК-транскрипты нескольких соседних генов, которые транслируются с образованием поли¬протеинов.
Полипротеины затем расщепляются на отдельные ви¬русные белки. В состав вирионов включаются только транскрип¬ты, содержащие весь геном. Вирусы, содержащие двухцепочечную РНК Двухцепочечный сегментированный геном реовируса транс¬крибируется вирионной полимеразой внутри частично «раздето¬го» капсида, через открытые вершины которого выходят 10 мРНК — плюс-транскрипты 10 генов (рис. 6). Молекулы мРНК выполняют две функции. Во-первых они транслируются, обеспечивая синтез вирусных белков, .и, во-вторых, они включа¬ются (по одной молекуле мРНК каждого из 10 генов) в состав частиц-предшественниц.
Каждая мРНК служит в этих частицах матрицей для синтеза комплементарной цепи, что ведет к обра¬зованию двухцепочечных сегментов генома. Геномы ДНК-содержащих вирусов Геномы ДНК-содержащих вирусов можно разделить на четы¬ре группы. Геномы папова адено- и герпесвирусов транскриби¬руются и реплицируются в ядре, поэтому они могут использовать для синтеза мРНК ферменты транскрипции хозяина.
Этим объ¬ясняется инфекционность ДНК указанных вирусов. У паповави-русов транскрипционная программа состоит по крайней мере из двух циклов, а у герпес- (рис.7) и аденовирусов по крайней мере из трех. В каждом случае структурные или вирионные по¬липептиды синтезируются на мРНК, появляющейся в последнем цикле транскрипции. Рис.7. Размножение герпесвирусов (вируса простого герпеса). Поксвирусы составляют вторую группу. Хотя ДНК поксвирусов удается обнаружить в ядре, по крайней мере начальные со¬бытия транскрипции и большая часть остальных событий цикла репродукции происходят в цитоплазме.
Начальная транскрипция происходит в сердцевине вириона. Многие вопросы, касающиеся цикла репродукции этого вируса, еще не выяснены. Парвовирусы входят в третью группу. К единственным виру¬сам этой группы, о которых доступна какая-то информация и ко¬торые способны заражать человека, относятся дефектные аденоассоциированные вирусы, нуждающиеся для своего размноже¬ния в аденовирусах или в вирусе простого герпеса в качестве вирусов-помощников.
Для их размножения требуются синтез в ядре клетки ДНК-цепи, комплементарной одноцепочечной ге¬номной ДНК, и последующая транскрипция генома. Вирус гепатита В является представителем четвертой группы (рис. 8). ДНК этого вируса сначала достраивается с помощью Рис.8. Размножение вируса гепатита В. ДНК-полимеразы, включенной в вирион, и превращается в сверхспиральную молекулу. Эта молекула транскрибируется с образованием молекул РНК двух классов-мРНК, кодирующей белки, и геномной РНК, которую затем транскрибирует обратная транскриптаза, синтезируя геномную ДНК. Сборка, созревание и выход вирусов из зараженных клеток В процессе эволюции у вирусов выработались две фундамен¬тальные стратегии, используемые ими при сборке, созревании и выходе вируса из зараженной клетки.
Первая, свойственная пикорнавирусам, реовирусам, паповавирусам, парвовирусам аде¬новирусам и поксвирусам, заключается в осуществлении сборки и созревания внутри клеток.
В случае пикорнавирусов 60 копий каждого из вирионных белков, обозначаемых VPO, VP1, VP3 собираются в цитоплазме в прокапсид. Затем вирусная РНК свертывается вокруг прокапсида, и в это время VP0 расщепляет¬ся на два полипептида VP2 и VP4. Возможно, расщепление вы¬зывает перестройку капсида в термодинамически стабильную структуру, в которой РНК защищена от нуклеаз. Поксвирусы и реовирусы также собираются в цитоплазме. В противополож¬ность этому сборка аденовирусов, папбвавирусов и парвовирусов происходит в ядре. Дезинтеграция зараженных клеток — непре¬менное условие для выхода из них всех вирусов, осуществляю¬щих сборку и приобретающих инфекционность внутриклеточно Накоплены данные, свидетельствующие о том, что угнетение ме¬таболизма макромолекул и последующая дезинтеграция зара-женной клетки осуществляются структурными белками этих ви¬русов.
Другая стратегия, используемая вирусами, имеющими обо¬лочку, среди которых можно назвать все РНК-содержащие виру¬сы с негативным геномом, тогавирусы и ретровирусы, состоит в сочетании последней ступени сборки вириона и выхода его из сраженной клетки.
При этом с внутренней и с наружной стороны в плазматические мембраны встраиваются вирионные белки; 1асть этих белков, находящаяся с наружной стороны мембраны, гликозилирована. Мембранные белки вируса агрегируют с обра¬зованием скоплений и вытесняют при этом мембранные белки хозяина. Вирусные нуклеокапсиды связываются с вирус-специ¬фическими белками, выстилающими цитоплазматическую по¬верхность этих скоплений, или с цитоплазматическими домена¬ми вирусных гликопротеинов (тогавирусы) и обертываются этими участками мембраны.
Во время этого процесса вновь образующийся вирион «выпячивается», или «отпочковывается», во внешнюю среду, окружающую клетку. В некоторых случаях (например, у орто- и парамиксовирусов) во время или после вы¬пячивания происходит разрезание и структурная перестройка одного из поверхностных белков, что наделяет вновь сформиро¬вавшийся вирион способностью заражать клетки.
Сборка и созревание вирионов путем отпочковывания от плазматической мембраны клетки представляют собой наиболее эффективный механизм выхода, поскольку он не зависит от дезинтеграции за¬раженных клеток. При этом изменения метаболизма клетки хозяина и ее целостности под влиянием вирусов, созревающих и выходящих из клетки указанным образом, значительно варьиру¬ют. По воздействию на клетки вирусы можно расположить в ряд от цитолитических (тогавирусы, парамиксовирусы, рабдовиру-сы) до фактически не лизирующих клетку (ретровирусы). Одна¬ко в результате встраивания вирусных гликопротеинов в поверх¬ность клетки перечисленные вирусы придают клетке новую анти¬генную специфичность и зараженная клетка может стать и ста¬новится мишенью для иммунных механизмов хозяина.
Нуклеокапсид вируса герпеса собирается в ядре. В отличие от других вирусов с оболочкой одевание и созревание происходят у него на внутренней поверхности ядерной мембраны.
Одетые ви¬русы накапливаются в пространстве между внутренним и внеш¬ним слоем ядерной мембраны, в цистернах цитоплазматического ретикулума, а также в везикулах, несущих вирус к поверхности клетки. Таким образом одетые вирусы надежно защищены от контакта с цитоплазмой. Вирусы герпеса являются цитолитическими и неизменно разрушают клетки, в которых они размножа¬ются. Подобно другим вирусам с оболочкой, эти вирусы сообщают зараженным клеткам новые антигенные свойства. Двунитевые ДНК-вирусы — вирусы, содержащие двуните¬вую ДНК в линейной (например, герпесвирусы, аденовирусы и поксвирусы) или в кольцевой форме (как папилломавирусы). Репликация двунитевых вирусных ДНК проходит обычным полуконсервативным механизмом: после расплетения нитей ДНК к ним комплементарно достраиваются новые нити. У всех вирусов, кроме поксвирусов, транскрипция вирусного генома происходит в ядре. Уникальна по механизму репродукция гепаднавирусов (вируса гепатита В). Геном гепаднавирусов представлен двунитевой кольцевой ДНК, одна нить которой короче (неполная плюс-нить) другой нити. После проникновения в клетку сердцеви¬ны вируса (1) неполная нить ДНК-генома достраивается; формируется полная двунитевая кольцевая ДНК (2) и созре¬вающий геном (3) попадает в ядро клетки.
Здесь клеточная ДНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует разные иРНК (для синтеза вирусных белков) и РНК-прегеном (4) — мат¬рицу для репликации генома вируса.
Далее иРНК перемеща¬ются в цитоплазму и транслируются с образованием белков вируса.
Белки сердцевины вируса собираются вокруг прегенома. Под действием РНК-зависимой ДНК-полимеразы ви¬руса на матрице прегенома синтезируется минус-нить ДНК (5), на которой образуется плюс-нить ДНК (6). Оболочка вириона формируется на HBs-содержащих мембранах эндоплазматической сети или аппарата Гольджи (7). Вирион вы¬ходит из клетки экзоцитозом. Однонитевые ДНК-вирусы. Представителями однонитевых ДНК-вирусов являются парвовирусы. Поглощенный вирус поставляет геном в ядро клетки.
Парвови¬русы используют клеточные ДНК-полимеразы для создания двунитевого вирусного генома, так называемой репликативной фор¬мы последнего. При этом на исходной вирусной ДНК (плюс-нить) комплементарно синтезируется минус-нить ДНК, служащая матри¬цей в синтезе плюс-нити ДНК для новых поколений вирусов. Па¬раллельно синтезируется иРНК, происходит трансляция вирусных белков, которые возвращаются в ядро, где собираются вирионы. Плюс-однонитевые РНК-вирусы. Это большая группа виру¬сов (пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы и др.), у которых геномная плюс-нить РНК выполняет функцию иРНК . Вирус (1), после эндоцитоза, освобождает в цитоплазме (2) геномную плюс-РНК, которая как иРНК связывается с рибосомами (3): транслируется полипротеин (4), который расщепляется на 4 структурных белка (NSP 1-4), включая РНК-зависимую РНК-полимеразу.
Эта полимераза транскрибирует геномную плюс-РНК в минус-нить РНК (матрицу), на которой (5) синтези¬руются копии РНК двух размеров: полная плюс-нить 49S геном¬ной РНК; неполная нить 26S иРНК, кодирующая С-белок капсида (6) и гликопротеины оболочки Е1-3. Гликопротеины синтези¬руются на рибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума, затем включаются в мембрану и гликозилируются.
Дополнительно гликозилируясь в аппарате Гольджи (7), они встраиваются в плазмалемму. С-белок образуете геномной РНК нуклеокапсид который взаимодействует с модифициро¬ванной плазмалеммой (8). Вирусы выходят из клетки почкова¬нием (9). Минус-однонитевые РНК-вирусы (рабдовирусы, парамиксовирусы, ортомиксовирусы) имеют в своем составе РНК-зави¬симую РНК-полимеразу.
Проникшая в клетку геномная минус-нить РНК парамиксовируса трансформируется вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой в неполные и полные плюс-нити РНК. Непол¬ные копии выполняют роль иРНК для синтеза вирусных белков. Полные копии являются промежуточной матрицей для синтеза минус-нитей геномной РНК потомства. Вирус связывается гликопротеинами оболочки с поверхно¬стью клетки и сливается с плазмалеммой (1). С геномной минус-нити РНК вируса транскрибируются неполные плюс-нити РНК, являющиеся иРНК (2) для отдельных белков и полная ми¬нус-нить РНК — матрица для синтеза геномной минус-РНК ви¬руса (3). Нуклеокапсид связывается с матриксным белком и гликопротеин-модифицированной плазмалеммой.
Выход вирионов — почкованием (4). Двунитевые РНК-вирусы. Механизм репродукции этих вирусов (реовирусов и ротавирусов) сходен с репродукцией минус-однонитевых РНК-вирусов.
Особенность репродукции состоит в том, что образовавшие¬ся в процессе транскрипции плюс-нити функционируют не только как иРНК, но и участвуют в репликации: они являются матрицами для синтеза минус нитей РНК. Последние в комплексе с плюс-нитями РНК образуют геномные двунитевые РНК ви-рионов. Репликация вирусных нуклеиновых кислот этих виру¬сов происходит в цитоплазме клеток. Ретровирусы (плюс-нитевые диплоидные РНК-вирусы, об-ратнотранскрибирующиеся), например вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ связывается гликопротеином gp120 (1) с рецептором CD4 Т-хелперов и других клеток.
После слияния оболочки ВИЧ с плазмалеммой клетки в цитоплазме освобождаются геномная РНК и обратная транскриптаза вируса, которая на матрице геномной РНК синтезирует комплементарную ми¬нус-нить ДНК (линейная кДНК). С последней (2) копируется плюс-нить с образованием двойной нити кольцевой кДНК (3), которая интегрирует с хромосомной ДНК клетки. С рекомбинантной ДНК-провируса (4) синтезируются геномная РНК и иРНК, которые обеспечивают синтез компонентов и сборку вирионов.
Вирионы выходят их клетки почковани¬ем (5): сердцевина вируса «одевается» в модифицирован¬ную плазмалемму клетки.