Методы введения ДНК в бактериальные клетки

Методы введения ДНК в бактериальные клетки. Для введения ДНК генов в клетки бактерий используются два метода. Первый основан на применении плазмиды в качестве вектора. В начале 1950-х гг вскоре после открытия Ледербергом процесса конъюгации Escherichia coli, было установлено, что типы спаривания клеток бактерий обусловлены генетически и что генетическая информация переносится из клеток мужского типа в клетки женского типа, или реципиентные клетки.

Способность служить донорными клетками или фактор плодовитости F передавалась при конъюгации значительно чаще, чем любой другой генетический признак. F-фактор передавался также независимо от любого другого известного гена донорной клетки. Ледерберг подметил, что F-фактор напоминает внехромосомные генетические элементы, имеющиеся в цитоплазме высших организмов.

Это наблюдение позволило ему в 1952 г. присвоить подобным внехромосомным генетическим системам общее название-плазмиды. В 1953 г. Хэйс, который в то время работал в больнице Хаммерсмита в Лондоне, установил, что в определенных условиях F-фактор может оказаться сцепленным с генетическими маркерами и индуцировать последовательный их перенос в ходе конъюгации. F-фактор присоединяется к бактериальной хромосоме в специфическом участке сайте именно в этой точке хромосома разрывается при конъюгации и начинается ее перенос в реципиентную клетку.

F-фактор способен также отделяться от хромосомы, захватывая подчас небольшие фрагменты хромосомы поэтому его можно рассматривать как виехромосомный элемент, который иногда интегрирует в хромосому. Жакоб и Вольман, сотрудники Института Пастера в Париже, отметили сходство в поведении F-фактора, умеренного бактериофага X, и другой плазмиды-Со1Е1 которая кодирует колицин-белок, убивающий клетки Е. coli. Для обозначения генетического элемента, который может реплицироваться либо в свободном состоянии, либо соединившись с бактериальной хромосомой, они предложили новый термин- эписома. В 1959 г. в Японии при исследовании больных бактериальной дизентерией, которые не поддавались лечению обычно эффективными антибиотиками, было сделано замечательное открытие.

В клетках патогенных бактерий Shigella dysenteriae были найдены гены, придававшие им устойчивость одновременно к нескольким антибиотикам такая устойчивость передавалась другим кишечным бактериям во многом подобно тому, как передается F-фактор.

Эти факторы устойчивости называемые R-факторами обладали сходством с F-фактором так, они были способны индуцировать передачу самих себя от клетки к клетке при конъюгации. Позже удалось показать, что некоторые из них содержат последовательности нуклеотидов, близкие к таковым F-фактора. В начале 1960-х гг. Новик обнаружил подобные факторы устойчивости у стафилококков они содержали ген, кодирующий фермент пенициллин-в-лактамазу, или пенициллиназу последняя расщепляет пенициллин и таким образом обеспечивает устойчивость к этому антибиотику.

R-факторы стафилококков, по-видимому, не способны обеспечивать передачу самих себя посредством конъюгации и переносятся лишь пассивно в процессе трансдукции, т. е. при их встраивании в ДНК бактериофага. Это открытие указывало на наличие нескольких R-факторов в клетках кишечных бактерий. К середине 1960-х гг. стало очевидным, что большинство R-факторов кишечных бактерий и стафилококков как и плазмида Со1Е1 отличаются от F-фактора и фага л тем, что остаются внехромосомными элементами их обратимого встраивания в хромосому клетки не происходит.

В строгом смысле они не соответствовали определению эписомы. В 1963 г. Новик предложил пользоваться предпочтительно термином плазмида, как более общим, а не эписома. В настоящее время термин плазмида является общепринятым. Плазмиды найдены почти у всех видов бактерий.

Штамм, содержащий плазмиду, способен давать начало вариантам, у которых плазмида утрачена в подобных случаях плазмида теряется окончательно, клетка не способна ее регенерировать и может только получить ее из другой бактериальной клетки. Плазмиды представляют собой кольцевые молекулы ДНК, по размеру соответствующие 1-3 генома бактериальной клетки, однако даже столь малая часть наследственного аппарата кодирует важные генетические признаки, которые обычно сама бактериальная хромосома не кодирует.

Например, они содержат информацию, необходимую для конъюгации бактериальных клеток, ими обусловлен ряд заболеваний растений и животных. Они позволяют клеткам использовать многие сложные соединения в качестве источников питания и обеспечивают устойчивость к разнообразным токсичным агентам, особенно к антибиотикам. Плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и ряду тяжелых металлов, вызывающих летальный эффект солям сурьмы, висмута, кадмия и свинца, ионам арсената и арсенита. Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид Е. соli. Наличием плазмид обусловлены также некоторые заболевания с выраженной диарреей, стафилококковый импедиго, створаживание молока и превращение его в сыр молочнокислыми бактериями, а также разнообразные биохимические реакции, характерные для бактерий рода Pseudomonas Плазмиды могут управлять синтезом инсектицида в клетках Bacillus thuringiensis 2 . Использование плазмид в качестве векторов для введения чужеродных генов в бактериальные клетки начиная с 1975 г. послужило толчком для интенсивных исследований их структуры и характера репликации.

Количество плазмид в клетке может колебаться от одной до более сотни в целом чем крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке.

Обычно репликация плазмиды регулируется независимо от репликации хромосомы. Поскольку плазмиды могут различаться по количеству копий водной и той же клетке, количество копий должно определяться регуляторной системой, присущей самой плазмиде.

Такая система была описана в 1972 г. датчанином Нордстрёмом из Университета Оденсе для плазмиды R1 Е. со1i сходные регуляторные системы были найдены у плазмид стафилококков. Количество копий плазмиды R1 зависит, по-видимому, от белка или белков, которые подавляют ее репликацию. Сегмент ДНК длиной не более двух тысяч пар нуклеотидов управляет репликацией плазмиды, которая более чем в 50 раз его крупнее. Долгое время считалось, что генетическая конституция всех клеток данного вида одинакова и не изменяется в течение длительного времени, однако, как оказалось, значительная часть генетических признаков, причем не только у бактерий, но и у высших организмов, нестабильна эти признаки имеются в одних клетках или штаммах и отсутствуют в других клетки могут терять их и приобретать вновь и мобильна способна переноситься между клетками или перемещаться в одной и той же клетке из одного локуса в другой. Такая нестабильность объясняетcя тем, что эти признаки определяются плазмидами и тугими атипичными генетическими системами.

При конъюгации бактериальных клеток может происходить обмен плазмидами между бактериями, принадлежащими к разным видам и даже родам, которые не способны обмениваться генами, находящимися в хромосомах.

Наконец, такой обмен может приводить к переносу генов, находящихся в плазмиде, из одного вида в другой при совместном росте и конкуренции, в результате чего реципиентные клетки приобретают способность выживать за счет донорных клеток.

Эти свойства показывают, что плазмиды способны к выживанию независимо от судьбы содержащих их клеток, они не только не снижают общей приспособленности клетки, но, напротив, снабжают ее дополнительными адаптивными функциями. В самом деле, плазмиды обладают способностью включать в себя новые гены, а уже содержащиеся в них гены перетасовывают так, что это, с одной стороны, не влияет на эффективность репликации самих плазмид, а с другой-наделяет клетку резервуаром генетической информации, которую она использует по мере надобности.

Второй метод, которым исследователи пользуются для введения гена в бактериальные клетки, основан на применении бактериофага в качестве вектора. Ген встраивают в геном вируса который содержит 10-50 генов, и он реплицируется вместе с генами вируса при размножении последнего в бактериальной клетке. 2