Достижения генной инженерии

Достижения генной инженерии. Группа Кораны синтезировала ген аланиновой тРНК дрожжей, структура которого к тому времени была полностью расшифрована.

Этот ген длиной 77 п. н. не содержал регуляторных последовательностей и поэтому не обладал функциональной активностью. Позднее та же группа авторов синтезировала первый функционально активный ген - ген супрессорной тирозиновой тРНК Е. coli длиной около 200 п. н. Генная инженерия открыла путь для производства продуктов белковой природы путем введения в клетки микроорганизмов искусственно синтезированных кодирующих их генов, где они могут экспрессироваться в составе гибридных молекул.

Первой удачной попыткой такого рода стала работа К. Итакуры и Г. Бойера с соавторами 1977 по экспрессии в Е. coil химически синтезированного гена, кодирующего гормон млекопитающих - соматостатин. Ген соматостатина был получен на основе сведений о первичном строении этого пептидного гормона, состоящего всего из 14 аминокислот. Использованный в этой работе подход оказался весьма перспективным для получения и многих других пептидных гормонов.

В различных лабораториях в СССР и за рубежом были созданы штаммы Е. coli, синтезирующие в составе гибридных белков гормон роста человека соматотропин, пептидные гормоны - брадикинин и ангиотензин, нейропептид лей-энкефалин и др. Ген гормона роста человека длиной 584 п. н наиболее длинный из искусственно синтезированных в настоящее время. Он был встроен в плазмиду, реплицирующуюся в Е. coli под контролем промотора триптофанового оперона. Трансформированные полученной химерной плазмидой клетки Е. coli продуцировали при индукции промотора около 3 млн. молекул гормона роста человека в расчете на клетку.

Этот полипептид, как было установлено в экспериментах на крысах с удаленным гипофизом, по функциям оказался полностью идентичен гормону роста человека. В 1976 г. Гилберт и Максам в Гарвардском университете, а также Сэнгер разработали быстрый метод химического анализа ДНК появилась реальная возможность определять последовательность до 1000 нуклеотидов в неделю силами одного исследователя.

В 1982-1985гг. стало возможно создать прибор для автоматического анализа нуклеиновых кислот а значит, генов. Анализ ДНК позволяет дедуцировать, основываясь на генетическом коде, аминокислотные последовательности белков, синтез которых находится под контролем соответствующих генов. С помощью созданного в результате совершенствования анализа белков микроанализатора Худа- Ханкепиллера Калифорнийский технологический институт, 1980 за день удается определять последовательность из 100-200 аминокислот, причем для этого требуется всего 10 нг белка 1 нг 10 -9 г 2 2 . Еще один важнейший этап-это синтез биополимеров по установленной структуре.

Первые коммерческие приборы, производящие автоматизированный синтез полипептидов, были разработаны на основе исследований Меррифилда в 1963 г. Они используются в исследовательских лабораториях и в фармацевтической промышленности. Метод химического синтеза генов обеспечил также возможность получения штаммов бактерий продуцентов инсулина человека, важного лечебного препарата для больных диабетом.

Ген инсулина синтезировали в вида более 40 в основном шестичленных олигонуклеотидов, которые затем объединяли в единую структуру с помощью ДНК-лигаэы. Полученные двух цепочечные полинуклеотиды длиной 271 и 286 пар оснований были встроены в плазмидные векторы. Туда же были встроены и регуляторные участки ДНК, обеспечивающие экспрессию гибридных молекул. Клонированные гены кодировали синтез проинсулина, который путем несложной химической обработки можно превратить в активный инсулин, включающий две полипептидные цепи А и В из 21 и 30 аминокислотных остатков, соединенных между собой сульфгидрильными связями 4 . Таким способом получены и клонированы гены, кодирующие глобины человека, животных и птиц, белок хрусталика глаза быка, яичный белок, фиброин шелка, продуцируемый тутовым шелкопрядом, и др. Этот же принцип был применен для получения, клонирования и экспрессии генов интерферона человека в бактериях.

Интерферон - ценный лекарственный препарат, широко используемый для борьбы с вирусными инфекциями и лечения ряда других заболеваний, включая злокачественные опухоли.

Интерферон вырабатывается в клетках животных и человека, но обладает выраженной видоспецифичностью. Ю. А. Овчинников и В. Г. Дебабов с сотрудниками получили микроорганизмы, эффективно синтезирующие интерфероны человека. Этим исследователям удалось сконструировать рекомбинантные плазмиды, обуславливающие синтез интерферона человека в Е. coli рис. 16.2 . Очищенный из клеток бактерий интерферон по своим физико-химическим и биологическим свойствам оказался близок интерферону, находящемуся в крови доноров.

За счет введения в векторную плазмиду сигнальных последовательностей, инициирующих синтез иРНК и белка, удалось получить бактерии, способные синтезировать до 5 мг интерферона а расчете на 1 л суспензии бактерий. Это в 5000 раз больше, чем содержится в 1 л крови доноров. Замена Е. coli на микробы некоторых других видов позволяет еще больше увеличить производительность такой фабрики интерферона. В 1980 г. Итакура создал первый синтезатор генов.

Вскоре после этого компания Био-Лоджикалс Торонто выпустила прибор, сконструированный Огилви в Университете МакГилла в Монреале прибор был способен в течение 6 ч синтезировать 12-членный олигонуклеотид с заданной последовательностью. В 1981 г. Худ, изобретатель белкового микроанализатора, создал другой автомат, выпускаемый фирмой Генетик инстраментс. Компания Био-Лоджикалс намеревалась до конца 1982 г. выпустить две модели синтезаторов олигонуклеотидов-одну полуавтоматическую, а вторую в комплексе с компьютером.

В 1982 г. цена этих приборов на американском рынке составляла 36000-39500 долл. 2 . К открытиям связанным с достижениями генной инженерии нужно прибавить то, что огромный генетический чертеж многоклеточного существа просчитан полностью. Я думаю это можно назвать достижением века. После восьми лет работы многих исследовательских групп удалось точно определить 97 миллионов пар нуклеотидов и их местонахождение в спирали ДНК, хранящей полную наследственную информацию микроскопического червячка Сaenorhabditis elegans длиной около миллиметра Хотя это очень маленький червь, скорее червячок, с него без всякого преувеличения начинается новая эра в биологии. Геном этой нематоды состоит из 97 миллионов пар нуклеотидов ДНК, округленно 0,1 миллиарда пар. Геном человека, согласно большинству оценок 3 миллиарда нуклеотидных пар. Разница в 30 раз. Однако именно эта работа, о которой идет речь, окончательно убедила даже самых закоренелых скептиков, что расшифровка строения всего генома человека не только возможна, но и достижима в ближайшие годы. В лабораториях мира полным ходом идет расшифровка генома человека. Эта международная программа была начата в 1989 году, тогда же благодаря инициативе и энергии выдающегося биолога, ныне покойного академика А. А. Баева, к программе подключилась и Россия.

В феврале этого года в Черноголовке под Москвой прошла конференция Геном человека-99 , посвященная десятилетию начала этих работ и памяти их инициатора, руководившего российской частью программы первые пять лет. Сейчас в разных странах мира, в лабораториях, разделивших между собой фронт работ всего надо прочитать около трех миллиардов пар нуклеотидов, ежедневно расшифровывается более миллиона нуклеотидных пар, причем темп работ все ускоряется. 6 Расшифровка, или, как говорят биологи, секвенирование, генома C. elegans была осуществлена по совместному проекту двумя исследовательскими группами из Центра геномного секвенирования Вашингтонского университета США и Сенгеровского центра Кембридж, Англия. В журнале Science от 11 декабря 1998 года опубликована серия статей, подробно рассказывающая об этой поистине грандиозной работе.

Естественно, расшифровать геном таких гигантских размеров, как у названной нематоды напомню 97 миллионов пар нуклеотидов ДНК , невозможно без огромной подготовительной работы.

Ее в основном завершили к 1989 году. Прежде всего была построена физическая карта всего генома нематоды. Физическая карта представляет собой небольшие участки ДНК известной структуры маркеры, расположенные на определенных расстояниях один от другого.

И вот с 1990 года началось само секвенирование.

Его темп составлял в 1992 году 1 миллион пар нуклеотидов в год. Если бы такой темп сохранился, на расшифровку всего генома понадобилось бы почти 100 лет! Ускорить работы удалось простейшим способом - число исследователей в каждом центре возросло примерно до 100. По мере того, как раскрывалась нуклеотидная последовательность ДНК C. elegans, пришлось расстаться с двумя заблуждениями.

Во-первых, оказалось, что генов у нее не 15 тысяч, как предполагали вначале, а 19099. Во-вторых, надежда на то, что гены сосредоточены в середине хромосом, а к концам сильно редеют, оправдалась лишь отчасти, гены распределены вдоль хромосом относительно равномерно, хотя в центральной части их все-таки больше.

Если у дрожжей функция половины генов в геноме неизвестна так называемые молчащие гены, то у червя эта доля еще больше из 19 тысяч генов 12 тысяч остаются пока загадочными. Значение секвенирования генома нематоды, конечно, выходит далеко за рамки того, что можно назвать полигоном для расшифровки генома человека. C. elegans - первый многоклеточный организм, геном которого раскрыт практически полностью. Можно напомнить два года назад был расшифрован первый геном эукариотического организма - дрожжей, то есть организма, клетки которого содержат оформленные ядра. К эукариотам относятся все высшие животные и растения, а также одноклеточные и многоклеточные водоросли, грибы и простейшие.

Дрожжи, согласно биологической систематике, относятся к одноклеточным грибам. Иначе говоря, за два года был пройден путь от генома одноклеточного до генома многоклеточного организма. Программа Геном человека, как уже говорилось программа общечеловеческая. Каждая лаборатория, в какой бы стране она ни находилась, вносит в нее посильный вклад.

И как только кому-то удается раскрыть структуру нового гена, эта информация немедленно поступает в Международный банк данных, доступный каждому исследователю. В России по этой программе работают около 100 исследовательских групп. 6 Молекулярная геномика. Особо мне хотелось бы отметить изменения в медицине происходящие за счет достижений генной инженерии. Наступающий ХХI век многие провозглашают веком генетики.

Современную генетику, изучающую химические механизмы наследственности, называют молекулярной геномикой. Сегодня молекулярная геномика - приоритетное направление научных исследований. Она влияет на развитие науки в целом и здравоохранения и медицины в частности. Молекулярная геномика создала предпосылки решения таких ключевых вопросов современной науки, как происхождение человека филогенез, возникновение рас и наций, пути их расселения по планете этногенез, развитие организма из одной единственной клетки онтогенез, проблема клонирования млекопитающих и человека.

Генетизация общества происходит буквально на наших глазах. А это, в свою очередь, не может не привести к качественным изменениям и в медицинской науке в ней наступает эпоха молекулярной медицины. Молекулярная медицина это - диагностика, лечение и профилактика наследственных и ненаследственных болезней на генном уровне. Уже в подходе к постановке диагноза молекулярная медицина принципиально отличается от обычной.

Главный вопрос традиционной медицины Чем вы болеете а молекулярной Чем вы можете заболеть при вашем геноме То есть молекулярная медицина выявляет генетическую предрасположенность человека к различным болезням. Следующая отличительная черта молекулярной медицины - лечение заболеваний как наследственной, так и ненаследственной природы проводится на генном уровне. В качестве лекарственного препарата выступают гены точнее - специальные генетические конструкции. Генная терапия не просто устраняет определенные симптомы заболевания, а корректирует функции клеток и организма в целом.

Её терапевтический эффект может достигаться различными путями замена больного гена на здоровый, направленная коррекция структуры и, соответственно, функции больного гена, частичное или полное подавление больного гена. И, наконец, еще один важный принцип молекулярной медицины любое медикаментозное лечение должно подбираться строго индивидуально, учитывая особенности генома больного. Этим занимается недавно возникшая наука - фармакогенетика.

Уже сегодня практическое применение молекулярной медицины весьма разнообразно. Это - и молекулярная диагностика наследственных заболеваний на любой стадии развития организма, в том числе и до рождения пренатальная диагностика, и определение генов предрасположенности к некоторым распространенным болезням, и геномная дактилоскопия - точная идентификация личности на основе анализа особенностей структуры его генома именно этот метод был с успехом применен при генетическом анализе останков царской семьи. В геноме человека насчитывается 35-50 тысяч различных генов, изменения в некоторых из них приводят к нескольким тысячам наследственных болезней.

Гены практически всех наиболее частых около 320 и сравнительно редких около 170 наследственных болезней уже известны. Методы их обнаружения достаточно просты и универсальны и поэтому широко применяются в медицине. Сейчас у нас в стране можно определить около 40 наиболее тяжелых наследственных болезней.

Молекулярная диагностика генов наследственных болезней проводится в НИИ акушерства и гинекологии в Санкт-Петербурге, в Научном центре медицинской генетики и Институте неврологии РАМН в Москве, в Институте биохимии и генетики научного центра РАН в Уфе, в Институте медицинской генетики в Томске и в Медико-генетическом центре в Новосибирске. Методы молекулярной диагностики позволяют выявить не только гены наследственных болезней, но и гены предрасположенности к тому или иному заболеванию. Гены предрасположенности - объект исследования многих научных групп по всей России.

Так, в Санкт-Петербурге на кафедре медицинской генетики Педиатрической академии активно изучаются гены предрасположенности к тромбофилии, варикозному расширению вен, сердечно-сосудистым заболеваниям, диабету, атеросклерозу в Институте экспериментальной медицины РАМН исследуются гены гиперхолестеринемии, приводящие к атеросклерозу и хроническим заболеваниям легких и печени, а в НИИ онкологии имени профессора Н. Н. Петрова - гены предрасположенности к опухолям легких и молочной железы.

Работы по этой тематике проводятся в Москве во Всероссийском кардиологическом центре РАМН, в Институте молекулярной генетики РАН и во Всероссийском онкологическом центре РАМН, а также в Томске - в Институте медицинской генетики. Молекулярная геномика уже применяется в Европе и Соединенных Штатах для решения разнообразных задач медицины и медицинской генетики. Например, в Великобритании созданы информационные центры, и каждый, позвонивший туда, может получить консультацию по любым вопросам, касающимся своей наследственности и генетической предрасположенности к различным заболеваниям.

Во Франции создана и используется на практике компьютерная экспертная система Сезам SESAM - Systeme Expert Specialisee aux Analyses Medicales для определения склонности человека к различным заболеваниям. Она включает собственно экспертную систему оценки риска возникновения заболевания, основанную на многочисленных лабораторных иммунологических, биохимических, серологических и генетических тестах более 80 , программу для обучения врачей основам молекулярной медицины, медицинское консультирование по результатам лабораторных тестов и популярный справочник для населения.

Программа прекрасно зарекомендовала себя во Франции, и хочется верить, что российские медики в недалеком будущем тоже смогут ее использовать. 5 Генная терапия. В настоящее время в мире около 400 проектов по генной терапии находятся на различных стадиях клинических испытаний 261 из них проходит первую стадию оценка токсичности , 133 - вторую испытание на небольшой группе тяжелобольных пациентов и только 3 проекта два по лечению рака мозга и один по гемофилии - на заключительной третьей стадии масштабные клинические испытания. Пока генная терапия применяется в основном в онкологии более 60 проектов. Примерно по 15 приходится на генную терапию инфекционных СПИД, гепатит В, туберкулез и моно генных заболеваний муковисцидоз, семейная гиперхолестеринемия, мукополисахаридозы, гемофилия А и др Методы генной терапии позволяют лечить различные генетические патологии в период внутриутробного развития.

Введенный ген или генная конструкция попадает во множество интенсивно делящихся клеток, предотвращая начало развития заболевания.

После такой терапии нет необходимости искусственного прерывания беременности - ребенок рождается здоровым. Но тем не менее вопрос о ее целесообразности поднимается все чаще и чаще - теоретически существует опасность внедрения искусственных генных конструкций в геном пол