Для инкубации брали изолированные образцы печени и мышц. После взвешивания (на электронных весах) либо сразу экстрагировали липиды (0ч, исходные значения), либо навески тканей помещались в 1 мл среды для инкубации в открытую пробирку. В качестве кислородной среды использовался физиологический раствор, насыщенный О2, в качестве бескислородной среды физиологический раствор, предварительно прокипяченный с последующим остужением до комнатной температуры в стекле под полиэтиленовой крышкой , без доступа воздуха). Образцы тканей инкубировались в течение 1 ч и 24 ч при комнатной температуре. Один образец ткани анализировался через 1 ч и 24 ч экспозиции без изоляции, in situ.
Выбор указанных сроков был обусловлен следующими причинами:
а) 0 мин – приближенное к исходному на момент смерти состоянию тканей;
б) 1 ч - срок, недостаточный для насыщения среды инкубации диффузией из атмосферы; возможно переживание ткани в течение этого времени и сохранение некоторых функциональных свойств;
в) 24 ч – развитие глубоких деструктивных процессов в тканях, срок, достаточный для насыщения кислородом среды инкубации.
После инкубации в тканевых образцах определяли содержание общих липидов и отдельных липидных фракций.
3. 3. Методы анализа липидов
3. 3. 1 Получение и очистка общего липидного экстракта
Экстракцию липидов из образцов миокарда проводили по Bligh E., Dyer W.A. [32]. Выбор данного метода для экстракции и очистки липидов был обусловлен его оптимальностью (благодаря поэтапному использованию растворителей с различной степенью полярности) для экстракции липидов из биологических структур, находящихся в водном растворе. Для этого к 1 мл среды инкубации с находящейся в ней навеской ткани добавляли экстрагирующую смесь (хлороформ, метанол в соотношении 1:2 по объему), гомогенизировали и выдерживали не менее 2 ч на холоде, периодически перемешивая. После экстракции осадок тканевых элементов отделяли фильтрованием. Затем добавляли хлороформ (в отношении 2,5:9 к количеству экстрагирующей смеси), смешивали и вносили такой же объем 0,02 % раствора хлорида кальция для удаления нелипидных примесей. Смесь хорошо перемешивали и оставляли стоять в холодильнике на сутки для расслоения фаз. Верхнюю водную фазу декантировали с помощью микродозатора. Полученный общий липидный экстракт использовали для дальнейшего качественного и количественного анализа липидов: брали аликвоты для количественного определения общих липидов –
ОЛ - 0,1 или 0,2 мл.
Оставшийся экстракт выпаривали и использовали для анализа липидных фракций.
3.3.2 Анализ общих липидов и их отдельных фракций
а) Количественное определение содержания общих липидов. Определение содержания общих липидов проводили методом разложения с серной кислотой. Для этого 0,1 и 0,2 мл общего липидного экстракта переносили в чистые пробирки и упаривали досуха при температуре 35-400С. К высушенным пробам добавляли 2 мл концентрированной серной кислоты (H2SO4) и нагревали в специальном металлическом блоке при температуре 190-2000С в течение 15-20 мин. Охлажденные пробы осторожно разводили 2 мл дистиллированной воды, перемешивали и определяли (после охлаждения) оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм для ОЛ в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 10 мм. Содержание общих липидов в пробах рассчитывали, пользуясь предварительно построенными калибровочными графиками.
Содержание ОЛ в пробах (в мг% на сырой вес ткани) рассчитывали по формуле [12]:
, где:
мкг ОЛ - количество ОЛ в пробе, мкг;
Vобщ - общий объем липидного экстракта, мл;
mтк - вес ткани, мг;
Vан - объем общего липидного экстракта, взятый для анализа, в мл;
100 - пересчетный коэффициент для выражения ОЛ в мг%.
б) Микроанализ липидных фракций с помощью микротонкослойной хроматографии. Фракционирование общих липидов проводили с использованием метода микротонкослойной хроматографии на силикагеле. Для этого общий липидный экстракт упаривали досуха при температуре не выше 35-400С и растворяли в 0,1 мл хлороформа. Полученный раствор служил исходным для проведения МТСХ.
Микротонкослойную хроматографию (МТСХ) проводили на стеклянных пластинках размером 5 х 7,5 см. В качестве носителя использовали силикагель "Л" или "ЛС" "Хемапол" (ЧССР) из расчета 20-30 мг на 1 см 2 площади пластины. Нанесение сорбента осуществляли методом осаждения его из хлороформа, что значительно сокращало время приготовления пластин. Для получения ровного слоя носителя силикагель взбалтывали в 8 - 10 мл хлороформа и выливали в установленную горизонтально чашку Петри со стеклянной пластинкой на дне.
После осаждения силикагеля и испарения хлороформа пластинки высушивали на воздухе в течение 10-15 мин. Слой силикагеля на пластинке разделяли скальпелем на 3-4 дорожки. Затем на каждую из них наносили 0,03-0,05 мл упаренного хлороформного экстракта липидов на расстоянии 0,3-0,5 см от края пластинки. После подсушивания на воздухе проводили разделение в системе растворителей: гексан-диэтиловый эфир-метанол-ледяная уксусная кислота в соотношении 9:2:0,2:0,3 по объему.
В качестве камеры для разделения использовали чашки Петри, на дно которых для поддержания пластинки помещали стеклянные стержни. Систему для хроматографии (объем 11,5 мл) вносили в камеру для ее насыщения за 10-15 мин до разделения. Подведение системы растворителей к пластинке осуществляли с помощью бумажного фитилька, очищенного от липидных примесей. Время прохождения растворителей до края пластинки составляло 5 - 7 мин, после чего осуществляли проток растворителя еще в течение 5 мин.
По окончании разгонки пластинку вынимали, сушили на воздухе и проявляли в парах йода. Для этого пластинку переносили в чашку Петри, на дно которой помещали несколько кристалликов йода. Отдельные классы липидов при этом определялись в виде желтоватых пятен на белом фоне в следующем порядке от места нанесения (старта):
- фосфолипиды (на старте),
- диацилглицерины,
- холестерин,
- свободные жирные кислоты,
- триацилглицерины,
- эфиры холестерина.
Идентификацию липидов проводили с помощью известных значений длины пробега (Rf), которые составляют для ФЛ –0; ДГ – 0,05; ХС – 0,12; СЖК – 0,26; ТГ – 0,55; ЭХ – 0,8 (35) (рис.7).
Контуры проявленных фракций очерчивали иглой и пластины оставляли на воздухе до исчезновения йода. Затем механическим путем фракции переносили (счищали) в пробирки. Элюирование (перевод липидов с силикагеля в раствор) фракций ДГ, CX, СЖК, ТГ, ЭХ проводили смесью хлороформа с метанолом (2:1 по объему), а ФЛ - смесью хлороформ-этанол-уксусная кислота (2:1:0,1 по объему). Двукратное элюирование практически полностью извлекает сорбированные липиды. После элюирования пробы отфильтровывали во вторую серию пробирок.
Количественное определение отдельных фракций проводили методом сжигания с концентрированной серной кислотой (см. "Количественное определение общих липидов"). После охлаждения определяли оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 400 нм для отдельных липидных фракций (ФЛ, ДГ, ХС, СЖК, ТГ и ЭХ) в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 10 мм. Содержание отдельных липидных фракций в пробах рассчитывали, пользуясь предварительно построенными калибровочными графиками. После определения количественных значений каждой фракции рассчитывали содержание отдельных видов липидов в % от суммы фракций.
3. 4. Статистическая обработка результатов исследований
Данные обрабатывали методом вариационной статистики по соответствующим биометрическим алгоритмам с использованием критерия Стьюдента [27].
Формулы для расчетов:
где: M(x) - среднее арифметическое значение;
n–число исследований;
х–единичное значение;
m–средняя ошибка средней арифметической;
t–показатель существенной разницы.
Достоверными считали различия между сравниваемыми величинами при P<0,05; P<0,01 и P<0,001. Статистическую обработку проводили с использованием ПЭВМ по стандартным программам.